鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起鸭、鹅、火鸡等家禽传染性败血症及浆膜炎的主要病原.目前主要通过基因缺失及基因回补的方法对鸭疫里默氏杆菌的基因功能进行研究.然而,目前使用的穿梭质粒pLMF03存在结合转移效率低、酶切位点少等缺陷,不能用于所有鸭疫里默氏杆菌基因的回补.为解决这一问题,文中将结合转移位点oriT、鸭疫里默氏杆菌复制起始基因pRA0726 ori、高表达启动子基因及多种酶切位点逐一克隆至质粒pPM5,构建了新的穿梭质粒pFY02.结果表明,该质粒能够稳定存在于鸭疫里默氏杆菌,且具有较高的结合转移效率.通过回补鸭疫里默氏杆菌tonB2基因缺失株表明,该质粒可用于鸭疫里默氏杆菌基因的回补.总之,文中构建的穿梭质粒pFY02更加完善了用于鸭疫里默氏杆菌基因回补的材料.

目的 研究RNA结合蛋白tristetraprolin在肺腺癌中的表达及抑制自噬作用的分子机制.方法 瞬时转染tristetraprolin过表达质粒,分别在转染tristetraprolin 24、48及72 h后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测肺腺癌细胞中tristetraprolin表达及自噬相关分子Beclin1、LC3II/LCI及p62的表达变化.瞬时转染tristetraprolin过表达质粒及加入TNF-α,将肺腺癌细胞分为空载组、tristetraprolin组、空载+TNF-α组及tristetraprolin+TNF-α组,应用免疫荧光和Western blot检测NF-?B p65、c-rel、p50分子在细胞核中表达情况.共转染tristetraprolin过表达质粒及IκBα-mut质粒,将肺腺癌细胞分为tristetraprolin空载组、IκBα-mut空载组、tristetraprolin组、IκBα-mut组及tristetraprolin+IκBα-mut组,采用RT-qPCR和Western blot检测tristetraprolin表达及自噬相关基因表达变化.结果 Tristetraprolin在肺腺癌细胞中RNA及蛋白水平表达低(P<0.001).过表达tristetraprolin后,自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在RNA及蛋白水平表达均较空载组降低(P<0.001).同时,过表达tristetraprolin后,细胞核内的p65及c-rel蛋白表达较空载组及空载+TNF-α组减少(P<0.05),但p50表达无明显变化(P>0.05).过表达tristetraprolin后,p65及c-rel核移位较空载组减少.共转染IκBα突变质粒及tristetraprolin过表达质粒后,NF-κB信号通路被阻断,自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在RNA及蛋白水平表达较tristetraprolin过表达组升高(P<0.05),NF-?B信号通路被阻断后tristetraprolin对自噬的抑制作用减弱.结论 Tristetraprolin在肺腺癌细胞中低表达,过表达tristetraprolin可能通过抑制NF-?B p65及c-rel核移位而抑制肺腺癌细胞自噬.

目的 本研究旨在探索视黄酸相关孤核受体α(RORα)对脓毒症炎症反应及其所致的心脏功能损害影响.方法 通过腹腔注射脂多糖(LPS)建立小鼠脓毒症模型,通过LPS刺激巨噬细胞,建立脓毒症细胞模型,采用细胞转染和小鼠尾静脉注射过表达质粒,以在细胞和组织中过表达RORα,进而探究RORα在脓毒症炎症反应和脓毒症所致心肌损伤中的作用.采用实时定量PCR试验、蛋白免疫印记试验检测RORα、NF-κB p65和炎症因子的变化,采用酶联免疫试验、病理切片等检测脓毒症小鼠心肌损伤的变化.结果 RORα在LPS刺激巨噬细胞中显著降低(P＜0.05);过表达RORα能够显著抑制LPS刺激巨噬细胞中炎症因子白介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达(P＜0.05)、NF-κB p65的核移位水平(P＜0.05)、脓毒症小鼠血清中炎症因子IL-1β和TNF-α的释放、降低脓毒症小鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量以及改善脓毒症所致的心肌病理损害.结论 RORα能够通过抑制NF-κB p65的核移位进而负性调控LPS刺激巨噬细胞中的炎症反应,从而缓解脓毒症小鼠的炎症反应及心肌损害.

采用PUC 19质粒转染大肠杆菌示踪加限制性内切酶指纹图谱分析法，对急性化脓性胆管炎时胆道病原菌肺脏播散进行了精确的示踪及定量研究。结果表明，大鼠胆管炎6h起肺组织均浆中出现标记病原菌并随时间延长逐渐增多，48h达到高峰，而支气管肺泡灌洗液中胆源性病原菌阳性率及菌量低于肺组织匀浆者，但48h二者已非常接近。本实验结果提示急性化脓性胆管炎时，胆道病原菌能迅速突破胆血屏障经循环到达肺脏定植，并能在较短时间内突破肺泡隔屏障进入肺泡腔，成为肺巨噬细胞反应的主要剌激物。

目的 探讨糖尿病肾病(DKD)大鼠转化生子因子(TGF)-β1调控胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1活化的作用.方法 TGF-β1(2 ng/ml)和(或)SCAP抑制剂(Fatostatin)、S1P抑制剂(AEBSF)、PI3K抑制剂(LY294002,Wortmain-in)、Akt抑制剂(Akt inhibitorⅧ)、mTOR抑制剂(rapamycin)、TβR1抑制剂(SB431542)处理培养的大鼠肾小球系膜细胞(MC),免疫荧光和Western印迹检测SREBP1的核移位和蛋白表达水平;Western印迹检测FN和CTGF蛋白表达;p3TP-Lux荧光素酶报告质粒和pCMV-β-gal或SREBP1 siRNA转染至MC或Smad3 WT/KO MC,TGF-β1处理24 h后检测p3TP-Lux荧光素酶活性.结果 与AdLacZ组大鼠肾组织中SREBP1蛋白水平相比,AdTGF-β1组明显增加(P<0.05).与Con组MC中SREBP1蛋白的核表达荧光强度相比,TGF-β1组明显增加(P<0.05),与TGF-β1组MC中SREBP1蛋白的核表达荧光强度相比,T+fato组明显降低(P<0.05).与Con组mSREBP1蛋白表达相比,TGF-β1组明显升高(P<0.05).与TGF-β1组mSREBP1蛋白表达相比,T+fato组和T+AEBSF组均明显降低(P<0.01).与Con组GFP荧光强度相比,TGF-β1组明显增加(P<0.05).与TGF-β1组GFP荧光强度相比,T+fato组明显降低(P<0.05).与TGF-β1组mSREBP1表达相比,T+LY组、T+Wort组、T+Akti组和T+rapa组均明显降低(均P<0.05).与TGF-β1组相比,T+RIinh组明显抑制了mSREBP1蛋白的表达(P<0.01).与ConB组mSREBP1表达相比,TGF-β1B组明显升高.ConB组Smad3 KO MC的p3TPLux荧光素酶活性与TGF-β1B组有显著差异(P<0.05).TGF-β1A组和TGF-β1B组mSREBP1蛋白表达无明显差异(P>0.05).与ConB组p3TP-Lux荧光素酶活性相比,TGF-β1D组明显增加(P<0.01);与TGF-β1D组p3TP-Lux荧光素酶活性相比,T+fatoA组明显抑制(P<0.01).TGF-β1 E组p3TP-Lux荧光素酶活性明显高于TGF-β1 F组(P<0.05).与ConD组SREBP1下游促纤维化蛋白CTGF和FN蛋白相比,TGF-β1D组均明显升高(P<0.05);与TGF-β1D组SREBP1下游促纤维化蛋白CTGF和FN蛋白相比,T+fatoA组则明显降低(P<0.05).结论 TGF-β1诱导SREBP1活化引起MC的脂质沉积是DKD发生的重要原因.然而TGF-β1活化SREBP1的作用机制则与SCAP/S1P、PI3K/Akt和TβR1密切相关.然而,TGF-β1的促纤维化作用又依赖SREBP1的活化诱导脂质沉积.因此SREBP1是防治DKD的新靶点.