目的:构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法:首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3)，在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo，shRNA慢病毒重组质粒构建成功后，将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞，从而获得病毒液。实验Ⅰ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组( n＝6)：空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组，各组分别转染MOI为10的相应病毒液，转染48 h时，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率，以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组( n＝36)：空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组，各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体)，于转染24、48和72 h时，采用CCK-8法测定细胞存活率，荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率。 结果:实验Ⅰ　成功构建了2种shRNA-A2aR慢病毒载体(shRNA-A2aR 1、3)。shRNA-A2aR 3病毒液滴度为3.5×10 8 TU/ml。与V组和shRNA-A2aR 1组比较，shRNA-A2aR 3组心肌细胞A2aR表达下调( P<0.01)，shRNA-A2aR 3慢病毒载体干扰效率73%。实验Ⅱ　选择shRNA-A2aR 3慢病毒载体转染24 h时，各组细胞存活率均>85%；转染48 h时，MOI5组和MOI10组细胞存活率>80%；转染72 h各组细胞存活率<70%。倒置荧光显微镜下可见，MOI5组荧光密度稍低，MOI10组转染48 h及MOI20组转染24 h时，荧光密度较高且细胞状态较好；转染72 h时各组心肌细胞活力明显下降、死亡细胞增加。Western blot显示：MOI10组转染48 h、MOI15组转染48 h、MOI20组转染24和48 h时干扰效率均>70%。 结论:成功构建了大鼠shRNA-A2aR慢病毒载体，且MOI为10、转染48 h或MOI为20、转染24 h为最佳转染方案。

目的:利用腺病毒包装质粒pBHGE3与携带LASP-1 siRNA的穿梭质粒pZD55-LASP-1、pCA13-LASP-1在HEK293细胞内，包装成病毒ZD55-LASP-1和Ad-LASP-1。方法:利用Effectene DNA转染试剂将质粒pBHGE3与质粒pZD55-LASP-1、pCA13-LASP-1分别感染HEK293细胞，纯化并扩增病毒。通过PCR鉴定Ad-LASP-1、ZD55-LASP-1是否包含目的基因，E1区是否缺失及有无野生型腺病毒污染。鉴定正确的病毒进行扩增，CsCl梯度离心纯化，TCID 50法测病毒滴度。 结果:PCR鉴定证明ZD55-LASP-1未混杂野生型腺病毒,且包含目的序列LASP-1 siRNA；Ad-LASP-1 E1区缺失,且包含目的序列LASP-1 siRNA。ZD55-LASP-1滴度为4×10 10 PFU/ml，Ad-LASP-1滴度为2×10 10PFU/ml。Western-blot证实ZD55-LASP-1在肿瘤细胞中表达E1A，Ad-LASP-1不表达E1A。 结论:靶向表达LASP-1 siRNA序列的病毒ZD55-LASP-1重组成功，为肾癌的下一步基因治疗提供了基础。

目的:构建并制备表达人CD137L蛋白的5型重组腺病毒（Ad5-CD137L），并初步研究其在小鼠中的抗肿瘤免疫效果。方法:将密码子优化CD137L蛋白的表达基因插入pDC316穿梭质粒,并与pBH-GloxΔE1,3Cre腺病毒骨架质粒，共同转染HEK293细胞，构建Ad5-CD137L种子。扩增并纯化后，对所得Ad5-CD137L重组腺病毒的插入目的基因与蛋白表达情况进行鉴定。检测Ad5-CD137L在C57BL/6小鼠体内的特异性细胞免疫和抗肿瘤免疫水平。结果:成功地构建了Ad5-CD137L，PCR和测序结果表明插入目的基因与构建理论值相符。免疫荧光法鉴定Ad5-CD137L能在HEK293细胞中表达目的蛋白，经Western印迹法鉴定该目的蛋白的相对分子质量约为25 000，与理论值相符。与空腺病毒相比，Ad5-CD137L能显著诱导小鼠特异性IFN-γ（ t=6.315， P=0.003），抗肿瘤免疫效果更显著（ t21 d=8.275， t29 d=4.492； t39 d=5.101， P均<0.001）。 结论:成功构建了Ad5-CD137L，该重组病毒具有特异性细胞免疫原性和抗肿瘤免疫效果。

人诺如病毒(norovirus,NoV)在体外难以培养,不宜采用经典疫苗的方式进行疫苗研发,以腺病毒为载体的重组腺病毒疫苗为诺如病毒疫苗的研发提供另一种路线选择.构建表达人GⅡ.4型诺如病毒VP1蛋白的重组腺病毒为该技术路线的疫苗研发奠定基础.首先使用PCR扩增诺如病毒VP1片段,通过酶切、连接、转化,克隆含VP1基因的pshuttle-CMV-VP1穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒进行同源重组,重组质粒鉴定正确后使用Pac I酶切线性化,转染至HEK293细胞进行病毒包装,包装成复制缺陷型的完整腺病毒颗粒命名为rAd-VP1,病毒传代后进行滴度测定,并感染HEK293细胞,通过Western Blot方法鉴定重组腺病毒外源蛋白VP1的表达情况.结果表明,包装传代后的重组腺病毒浓缩后滴度达到CCID50=5×109/mL,并且能在HEK293细胞成功表达VP1蛋白.研究为rAd-VP1 的动物免疫评价和诺如病毒的疫苗研发提供基础.

目的 构建一种特异性标记过氧化物酶体的GFP腺病毒载体.方法 设计含过氧化物酶体信号肽的GFP序列,PCR法扩增该序列片段,并将其与腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack连接,然后将连接产物转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中获得重组质粒并测序鉴定.重组质粒经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后,转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞中进行同源重组.重组腺病毒质粒经限制性内切酶Pac Ⅰ酶切线性化后感染293A细胞,进行病毒包装,得到含过氧化物酶体信号肽的Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒.用腺病毒Ad-GFP-Peroxi和不含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP感染培养的大鼠心肌细胞H9C2,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光强弱.将用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染的H9C2细胞分为正常培养组和1％O2浓度培养组,培养24 h后于共聚焦显微镜下观察,并进行荧光信号聚集情况分析.结果 含过氧化物酶体信号肽的GFP腺病毒载体构建成功.与不含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP相比,含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP-Peroxi能够特异性显示大鼠心肌细胞H9C2内过氧化物酶体的分布,且缺氧培养的H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象.结论 利用同源重组方法成功构建了过氧化物酶体特异性GFP腺病毒,其对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率,共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况.

目的 构建表达dsRNA的双向启动子以及靶基因AaCPR100A的大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315-AaCPR100A.方法 以苏云金芽孢杆菌pSVP27A质粒为模板通过PCR扩增苏云金芽孢杆菌Cry3A正向启动子Pro-1(+);以埃及伊蚊RNA反转为cDNA为模板,扩增靶基因AaCPR100A;将大肠-苏云金穿梭载体pHT315质粒经Hind Ⅲ和Sal Ⅰ双酶切线性化;按照转录方向将正向启动子与靶基因通过无缝克隆插入穿梭载体pHT315中;以生物合成的含有Cry3A反向启动子序列的质粒为模版,经PCR克隆扩增Pro-1(-)反向启动子;将含有正向启动子与靶基因的中间载体通过EcoRⅠ限制性酶切酶线性化,按转录方向在靶基因下游通过无缝克隆插入反向启动子.结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,正向启动子、靶基因AaCPR100A和反向启动子PCR产物条带清晰,质量良好,可用于无缝克隆实验;经无缝克隆连接双向启动子以及靶基因片段后,对含有重组载体pHT315-AaCPR100A的重组质粒进行PCR验证,在重组载体中成功扩增正向启动子、靶基因片段以及反向启动子,经核苷酸测序验证双向启动子序列以及靶基因序列测序结果与序列比对结果基本一致,符合构建载体元件的要求,证明重组载体构建成功.结论 本研究利用无缝克隆技术成功构建含有双向启动子以及靶基因的重组穿梭载体,为构建表达伊蚊表皮蛋白基因AaCPR100A dsRNA的苏云金芽孢杆菌工程菌奠定基础.

[背景]大麻素是植物的天然活性产物,是一种重要的临床药物.目前药学相关大麻素的生产仍然依赖植物,但植物生产效率低、周期长并且受安全等因素限制.利用生物方法合成大麻素及其类似物具有重要意义.[目的]在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ5464-npgA中重构大麻素前体物 2,4-二羟基-6-正庚基苯甲酸(sphaerophorolcarboxylic acid,SA)的生物合成途径,优化发酵培养基组分,利用生物合成途径高效生产SA.[方法]从罗伯茨绿僵菌(Matarhizium robertsii)ARSEF 23 基因组扩增Mr_OvaA、Mr_OvaB、Mr_OvaC基因,分别构建到不同酵母-大肠杆菌穿梭质粒中,共同转化酿酒酵母 BJ5464-npgA 表达,获得酵母工程菌株 CLB2.通过单因素试验及Plackett-Burman、最陡爬坡试验和响应面法设计优化发酵培养基,使用Design Expert 8.0 对试验数据进行分析.[结果]酵母工程菌株CLB2 可以合成 63.75 mg/L SA.培养基各成分中影响SA产量的 3 个主要因素为:蔗糖、KH2PO4 和维生素溶液,其最佳浓度分别为蔗糖 7.26 g/L、KH2PO4·7H2O 6.08 g/L、维生素溶液 5.67 mL/L,预测产量最大值为 93.15 mg/L,实际产量为 93.75 mg/L,较优化前提高了 47%.[结论]大麻素前体物 SA 可以在酿酒酵母中高效合成.试验获得的高产发酵培养基配方为后续SA及大麻素的研究提供了可靠的支持.

目的:构建和包装携带肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hgs)全长基因的重组腺病毒,并研究Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响.方法:PCR扩增Hgs全长cDNA,将其连接到pMD18-T载体上,测序确认正确后将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,该载体线性化后转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-Hgs;将pAd-Hgs线性化后经脂质体转染293A细胞进行Ad-Hgs病毒的包装与扩增;用得到的Ad-Hgs腺病毒感染心肌细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western 印迹、real-time PCR确认病毒感染的有效性以及Hgs过表达情况;通过Western印迹检测自噬标志物LC3的转换(LC3B-Ⅱ/LC3B-I),以分析Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响.结果:包装了携带Hgs基因的重组腺病毒Ad-Hgs;Ad-Hgs重组腺病毒感染心肌细胞后,荧光显微镜观察到明显的GFP表达;real-time PCR、Western印迹结果显示Hgs在心肌细胞中得到过表达;Western印迹结果证明,Hgs过表达导致心肌细胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显升高.结论:通过包装携带Hgs cDNA的重组腺病毒,发现Hgs过表达促进心肌细胞自噬.

目的:本研究旨在构建携带间质细胞衍生因子1a (Stromal cell derived factor-1a,CXCL12/SDF-1a)基因慢病毒载体,探索CX-CL12慢病毒转染脂肪间充质干细胞(ADSCs)及CXCL12的表达,并观察其对内皮祖细胞的趋化作用.方法:利用PCR的方法从基因库调取并扩增CXCL12基因,克隆到穿梭质粒pLenO-GTP的表达框中,将重组pLenO-GTP载体质粒和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收获并测定病毒滴度,以最适MOI值转染ADSCs,通过western-blot方法测定转染的ADSCs表达的CXCL12,将过表达CXCL 12的脂肪干细胞移植到裸鼠背部,3天后流式细胞术鉴定外周血中的血管内皮祖细胞(EPC)的数量变化.结果:CXCL12基因PCR产物电泳与测序结果均正确.重组pLenO-GTP-CXCL12质粒酶切后产物电泳结果正确,含有CXCL12基因的穿梭质粒构建正确.穿梭质粒与慢病毒包装质粒共同感染293T细胞收获CXCL 12慢病毒.测得病毒滴度为1.4× 109 TU/ml.重组慢病毒感染ADSCs的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值为50.western-blot检测结果慢病毒感染的ADSCs高表达CXCL12/SDF-1a,过表达CXCL12基因组裸鼠外周血EPC明显高于其余两组.结论:重组CXCL12慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度病毒液,感染人ADSCs能稳定过表CXCL12蛋白,并可趋化骨髓内EPC进入外周血,为临床获取应用EPC提供了一种新的方法,为进一步研究过表达CXCL12的ADSCs,促进移植脂肪成活及血管化奠定基础.

目的 构建腺病毒载体使其携带血管紧张素转换酶(ACE)基因短发夹RNA(shRNA),观察选择性下调大鼠血管平滑肌细胞ACE表达.方法 从之前构建的真核表达载体p-ACE-shRNA中扩增ACE-shRNA片段,采用RT-PCR法并克隆进穿梭质粒pDC316中,将构建好的pDC316-ACE-shRNA穿梭质粒载体和pBHGlox-E1,3Cre骨架病毒共转染293细胞,进行病毒颗粒包装重组、滴度测定和纯化.随后进行原代培养大鼠血管平滑肌细胞转染,通过实时荧光定量PCR分别在转柒前及转染后24h、48h、72 h检测ACE mRNA的表达.结果 经PCR检测证实携带ACE-shRNA重组腺病毒载体构建成功并制备出了高滴度重组病毒,大鼠血管平滑肌细胞被转染后24 h,ACE mRNA表达无明显变化;被转染后48h,ACE mPNA表达显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05);被转染后72h时ACE mRNA表达更低.结论 本实验成功构建重组腺病毒载体其携带ACE-shRNA片段,同时证实shRNA可选择性下调原代培养大鼠血管平滑肌细胞上ACE表达,可能为心血管病基因治疗提供新思路.