目的:探讨人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）分泌的外泌体对损伤后肌腱细胞修复的影响及其机制。方法:组织块贴壁法分离并纯化筛选出能稳定传代培养的hUC-MSCs，倒置荧光显微镜观察细胞形态，通过流式细胞术检测hUC-MSCs的免疫表型。应用诱导培养基诱导hUC-MSCs向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化并进行鉴定。运用高速离心法提取MSCs的分泌物外泌体（MSCs外泌体），用Western blot技术和电镜检测外泌体，用PKH67染色荧光法检测外泌体膜融合能力。40只Wistar鼠按随机数字表法分为肌腱损伤组和正常组，每组20只。肌腱损伤组：切断跟腱1周后用100 mg/kg戊巴比妥钠处死，取跟腱组织用胰蛋白酶消化得到损伤肌腱细胞。正常组：不做任何处理直接处死，与损伤组并行处理得到正常肌腱细胞。将外泌体与体外培养的肌腱细胞共培养，12，24，48，72 h后通过细胞计数CCK-8检测肌腱细胞增殖情况。hUC-MSCs外泌体处理细胞24 h后，采用Western blot、qPCR、免疫荧光方法检测外泌体对肌腱细胞转化生长因子-β（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。结果:鉴定了hUC-MSCs，并成功分离hUC-MSCs外泌体。分离培养的MSCs呈梭形，丙氨酸氨肽酶（CD13）、整联蛋白β-1（CD29）、ecto-5'-核苷酸酶（CD73）、胸腺细胞表面抗原（CD90）和内皮素（CD105）呈阳性，人类白细胞DR抗原（HLA-DR）、造血祖细胞抗原（CD34）、白细胞共同抗原（CD45）呈阴性。分离出的外泌体经PKH67染色鉴定证实，在电镜下呈直径30~100 nm的圆盘、内部凹陷结构，Western blot检测高表达移动相关蛋白-1（CD9）和溶酶体相关膜蛋白3（CD63）。处理肌腱细胞后，CCK-8检测12，24，48，72 h细胞活性，结果表明肌腱损伤组显著高于正常组（ P < 0.01），qPCR结果表明肌腱损伤组TGF-β（1.850 ± 0.127）、BMP（2.133 ± 0.398）、FGF（1.610 ± 0.223）、VEGF（2.207 ± 0.059）的mRNA表达显著高于正常组TGF-β（1.004 ± 0.105）、BMP（1.007 ± 0.145）、FGF（1.007 ± 0.140）、VEGF（1.001 ± 0.065）（ P < 0.05），而肌腱损伤组IL-1β（0.102 ± 0.009）、TNF-α（0.130 ± 0.013）的表达显著低于正常组IL-1β（1.004 ± 0.113）、TNF-α（1.006 ± 0.134）（ P < 0.01）。Western blot检测结果与qPCR检测趋势一致。 结论:hUC-MSCs分泌的外泌体通过上调生长因子TGF-β、BMP、VEGF、FGF的表达，抑制炎性因子IL-1β、TNF-α的表达，促进肌腱细胞生长，促进肌腱细胞损伤修复。

目的:探讨单轴、双轴循环拉力对小鼠肌腱源性干细胞(TDSCs)分化的影响，为临床肌腱损伤后的康复治疗提供理论基础。方法:取6～8周龄C57BL/6小鼠10只，无菌条件下暴露双侧后腿至脚掌，显微镜下解剖收集小鼠髌腱和跟腱组织块，体外分离培养细胞，观察第3代细胞的形态特点。(1)取传代至第3代的细胞，采用流式细胞术检测间充质干细胞标志物(CD44、CD90、Sca-1)、内皮细胞标志物(CD34、Flk-1)、造血细胞标志物(CD45)，鉴定细胞是否符合TDSCs特点。(2)取传代至第3代的TDSCs进行成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化培养，分别采用茜素红、油红和阿尔新蓝染料对培养的三系细胞进行染色，鉴定细胞是否具有多向分化潜能。(3)取传代至第3代的TDSCs接种到硅胶底培养皿上，分为双轴循环拉力组、单轴循环拉力组、对照组3组。双轴循环拉力组细胞使用Flexcell ? FX-4000TM柔性基底拉伸加载系统，单轴循环拉力组细胞使用自制拉伸力生物反应器，对照组细胞无拉力。双轴循环拉力组、单轴循环拉力组施加机械负荷组的参数均设置为0.25 Hz、6%的循环拉力，在培养期间进行机械负荷加载，每天加载8 h，共加载6 d。第6天机械负荷刺激结束后，收集3组细胞进行实时荧光定量PCR (qPCR)，检测肌腱、成骨、脂肪和软骨相关转录因子的表达。 结果:显微镜下观察第3代TDSCs形态一致，呈梭形纤维状。(1)流式细胞技术检测结果显示，间充质干细胞标志物CD44、CD90和Sca-1表达阳性、内皮细胞标志物CD34和Flk-1表达阴性、造血细胞标志物CD45表达阴性，符合TDSCs标记鉴定特点。(2)三系分化细胞检测结果显示，提取的细胞成功分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，验证了提取的细胞具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。(3)对照组、单轴循环拉力组、双轴循环拉力组3组间比较，肌腱、成骨、软骨、脂肪相关转录因子的相对表达量差异均有统计学意义( P值均<0.05)。组间两两比较：单轴循环拉力组与对照组比较，肌腱、成骨相关转录因子以及脂肪相关转录因子PPARγ的相对表达均增高，软骨相关转录因子的相对表达均降低，差异均有统计学意义( P值均<0.05)，而脂肪相关转录因子CEB/P的相对表达差异无统计学意义( P>0.05)；双轴循环拉力组与对照组比较，肌腱相关转录因子Scx、Mohawk的相对表达降低，成骨相关转录因子Runx2的相对表达增高、碱性磷酸酶(ALP)的相对表达降低，软骨相关转录因子Sox9相对表达增高、Col2a1的相对表达降低，脂肪相关转录因子的相对表达均增高，差异均有统计学意义( P值均<0.05)；单轴循环拉力组与双轴循环拉力组比较，双轴循环拉力组肌腱相关转录因子Scx、Mohawk、Col1a1的相对表达均降低，成骨相关转录因子ALP的相对表达降低，软骨、脂肪相关转录因子的相对表达均增高，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。 结论:单轴循环拉力诱导TDSCs向肌腱细胞、成骨细胞分化，而双轴循环拉力诱导TDSCs向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。单轴循环拉力的作用下可以促进体外TDSCs向肌腱细胞分化，有利于肌腱组织的再生和损伤后的修复，为临床肌腱损伤后的康复治疗提供了理论依据。

肌腱损伤为临床常见病,由于肌腱自身愈合能力较差,自然愈合常形成瘢痕组织,无法达到功能性恢复,严重影响患者的运动功能及生活质量.现有治疗手段虽均已取得一定成效,但仍无法完全恢复损伤肌腱的原有结构及功能.近年来,间充质干细胞衍生的外泌体作为组织修复与再生领域的新兴手段虽已广泛应用,但针对间充质干细胞外泌体治疗肌腱损伤的研究较少,且具体机制并不完善.本文针对不同源性间充质干细胞外泌体对肌腱损伤修复作用的研究进展及其相关组织工程技术作一综述,为肌腱损伤的临床治疗及应用研究提供理论支持.

背景:肌腱病是一种肌肉骨骼疾病,以疼痛和活动能力下降为特征,伴有胶原蛋白紊乱和血管增生的病理变化.肌腱病常易发生在运动员、体力劳动者和老年人身上.肌腱病的机制之一是"失败的愈合反应",而导致失败愈合反应的部分原因是肌腱干细胞的错误分化.目的:通过阅读相关文献,介绍肌腱干细胞的特性,总结影响肌腱干细胞向肌腱细胞分化的因素以及导致肌腱干细胞错误分化(分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞)的因素,同时阐述肌腱干细胞在临床中的应用局限.方法:检索PubMed及Web of Science数据库中相关文献,检索词为"Tendon Stem/Progenitor Cells,Tendinopathy,Tendon injury,differentiation",通过阅读筛选出相关文献,最终纳入109篇文献进行结果分析.结果与结论:①肌腱干细胞是可以自发分化为肌腱的一种干细胞,它具有自我更新、克隆和多向分化的能力,不同的外部条件作用于肌腱干细胞可以导致其向不同方向分化.调节肌腱干细胞命运的具体因素并不确定.当肌腱中的干细胞更新和分化出现异常时,会导致肌腱愈合失败,进而导致肌腱病.②衰老、细胞外基质成分的变化、过度的机械刺激、前列腺素E2和白细胞介素6以及白细胞介素10和一些系统性疾病可能对调控肌腱干细胞的错误分化有重要意义.③促进肌腱干细胞向腱细胞分化的可能有利因素有:一些生长因子和细胞因子、适度的机械刺激和细胞外基质的地形、低氧张力、药物以及某些转录基因和蛋白.④目前最为理想的治疗手段则是对内源性肌腱干细胞进行调节,或者外源性肌腱干细胞刺激内源性肌腱干细胞的增殖分化.⑤未来研究进一步了解调节肌腱干细胞错误分化的因素,可深入了解肌腱病的发病机制并找到治疗靶点,阐述诱导肌腱干细胞向肌腱分化则可促进其在组织工程中的应用.

肌腱是肌骨系统的一部分,是将力量从肌肉传递到骨骼的结缔组织,在急性或慢性损伤后,由于本身的性质独特,肌腱的强度易受影响,易发生粘连并出现再次受伤的情况.在本病的治疗上除常规的物理疗法及手术治疗外,生物技术作为一种新颖且前景广阔的方法正逐步应用于临床.外泌体是一种双层膜结构的囊性小泡,包括多种蛋白标志物、DNA片段及RNA,近年研究发现,外泌体在肌腱病的治疗中发挥了抗炎、免疫调节和细胞修复等作用.本文通过对不同来源的外泌体在肌腱损伤修复的研究进展进行综述,概括并总结该领域最新的与临床转化相关的组织工程技术,旨在为后续研究提供一定参考.

背景:成纤维生长因子2作为腱-骨愈合和软骨修复过程中重要的生长因子,对加速腱-骨愈合和软骨修复有积极的促进作用.目的:综述成纤维生长因子2在腱-骨愈合及软骨修复方面的应用及目前面临的问题.方法:计算机检索CNKI数据库、PubMed数据库以及Elsevier数据库,中文检索词为:"成纤维生长因子,肌腱,骨,软骨,修复,组织工程".英文检索词为:"fibroblast growth factor 2,tendon,bone,cartilage,repair,tissue engineering".检索2000年1月至2018年3月收录的有关成纤维生长因子2在腱-骨愈合和软骨修复方面的文章.通过阅读文题和摘要进行初步筛选,排除与文章主题不相关的文献,最终纳入64篇文献进行结果分析.结果与结论:①成纤维生长因子2在腱-骨愈合过程中有重要的作用,能够加速腱-骨愈合.其主要是通过诱导转化生长因子和骨形态发生蛋白基因的表达,促进骨髓间充质干细胞增殖和Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的含量;②成纤维生长因子2对软骨损伤修复也有明显的促进作用,通过激活FGF/FGFR2等通路促进骨髓间充质干细胞的增殖,调节其SOX9的表达,促进其向软骨分化.作用于软骨下骨,上调软骨下骨中骨形态发生蛋白2和4等内源性生长因子的表达,从而促进软骨的形成;③但是,当前关于对成纤维生长因子2的研究还处于基础实验阶段,尚缺乏大量临床试验的证据.

目的:观察糖尿病大鼠髌腱来源的肌腱干细胞( TDSCs)体外成脂分化的潜能,探讨糖尿病对TDSCs成脂分化潜能的影响.方法:采用链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,提取大鼠髌腱TDSCs;观察细胞形态,并在体外诱导其成脂分化,通过油红O染色和检测成脂分化相关基因( C/EBP和PPARγ2)的mRNA表达,比较糖尿病组与对照组TDSCs成脂分化潜能的差异.结果:造模后糖尿病组血糖水平显著高于对照组,并持续 高于250 mg· dl -1.对照组TDSCs( hTDSCs)形态在镜下表现为均一的细长纺锤型,而糖尿病组TDSCs( dTD-SCs)表现为多突的纺锤型.成脂分化诱导9 d后,经油红O染色,对照组细胞内可见大量的脂滴形成,而糖尿病组细胞内仅有少量的脂滴形成,dTDSCs油红O染色阳性率显著低于对照组. dTDSCs C/EBP、PPARγ2的mRNA水平也显著低于hTDSCs.结论:糖尿病TDSCs体外成脂分化能力较hTDSCs显著降低,此结果为进一步揭示糖尿病肌腱病变过程中,持续体内高糖环境对TDSCs成脂分化功能影响的潜在分子机制提供了细胞生物学依据.

目的 观测小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)诱导的胰岛素分泌细胞(IPCs)在大鼠胰腺脱细胞支架上的生长及功能发挥.方法 经脾动脉持续灌注洗脱剂制备胰腺脱细胞支架,对其进行组织染色,DNA、糖胺多糖(GAG)含量,生物相容性检测.含小鼠肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)、胰腺十二指肠同源异型盒-1(PDX-1)和神经源性分化因子-1(NeuroD1)的腺病毒联合导入mBMSCs,免疫荧光、实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测胰岛素(Insulin)表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测不同浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌情况.IPCs再种植于脱细胞支架内,培养后行苏木素-伊红(HE)染色、免疫荧光、FQ-PCR检测细胞生长及功能发挥.结果 经灌注后未见细胞残留,可见细胞外基质(ECM)保留,DNA定量提示细胞含量为(44.92±3.89) ng/mg(t=15.160,P=0.001),GAG含量为(30.27±2.70) ng/mg,(t=2.862,P=0.046),免疫组织化学显示胶原Ⅰ、纤连蛋白保留.三基因修饰的mBMSCs Insulin表达阳性,葡萄糖刺激试验显示其对不同浓度葡萄糖有反应.将IPCs在胰腺脱细胞支架内循环灌注培养,HE染色显示细胞在支架内生长良好,免疫荧光和FQ-PCR显示Insulin表达阳性,与二维培养比较,Insulin表达提高(t=15.030,P=0.004).结论 制备的大鼠胰腺脱细胞支架保存了基本的脉管结构及ECM,生物相容性良好.PDX-1、NeuroD1和MafA协同促进mBMSCs分化并获得Insulin合成和分泌能力.经三维循环灌注培养,IPCs能够在支架内生长及发挥功能,且细胞功能得到促进.

目的 探究大鼠尾腱细胞外基质制备方法及其复合脂肪间充质干细胞构建微组织,为组织工程法修复肌腱损伤所需生物材料提供实验基础.方法 取 20 只 150 ～ 200 g SD 大鼠鼠尾作为实验材料,分别抽取出大鼠尾腱,经 PBS 彻底清洗后反复冻融 3 次,然后经过 1% SDS 于室温下处理 24 h,并用大量 PBS 清洗 1 周除去细胞残渣,最后 60Co 消毒备用.对制备的大鼠尾腱细胞外基质进行病理学染色,观察细胞残留情况.同时,检测该来源的生物源性材料残留 α-Gal 含量.此外,观察制备的大鼠尾腱细胞外基质复合脂肪间充质干细胞对细胞增殖的影响.同时,用 CCK-8 试剂盒检测该生物材料的细胞毒性.结果 大体观察可见,经脱细胞处理过的尾腱体积增大,呈乳白色匀浆状.HE 以及 DAPI 染色结果显示,经脱细胞处理后的尾腱细胞核大量减少,细胞数量显著降低,每个高倍镜视野内细胞残余量不大于 5 个.脱细胞尾腱残留α-Gal 含量与正常尾腱相比有统计学差异,脱细胞尾腱残留DNA 极少.复合脂肪间充质干细胞培养 7 d 相比培养 1 d活细胞数量明显增多.CCK-8 毒性测试结果显示这种脱细胞大鼠尾腱的生物相容性较好,没有细胞毒性.结论 经过脱细胞方法制备的大鼠尾腱细胞外基质可有效除去细胞成分,并且与脂肪间充质干细胞有较好的生物相容性,可作为一种生物材料用于肌腱损伤修复.

膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是膝关节的慢性退变性疾病.KOA的主要病理改变是关节软骨的进行性破坏,软骨下骨质丢失.目前临床上对于早中期KOA的治疗方法十分有限.富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)是外周血多次离心后的血小板浓缩物,在医学专业应用近三十年,近十年逐渐应用于骨科修复软骨、肌腱和韧带等,成为治疗KOA的热点.PRP治疗KOA的可能机制主要包括通过释放多种生长因子、促进蛋白多糖和胶原蛋白的合成以及刺激骨髓间充质干细胞和内源性透明质酸(hyaluronic acid,HA)的生成,达到修复软骨、延缓KOA进展的目的.多数研究表明,相对于传统的关节腔内注射药物和口服非甾体抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drugs,NASIDs),关节内注射PRP可有效改善KOA病人的临床症状,但是关于PRP的作用时间、使用剂量和注射次数尚无统一标准.本文通过回顾目前关于PRP治疗KOA的基础、动物及临床研究,对PRP的生物学特性、作用机制、临床疗效及存在的问题进行综述.