间充质干细胞（MSCs）外泌体能够通过旁分泌作用，发挥类似干细胞的促进组织器官修复再生的功能，避免了直接移植MSCs的风险，如致瘤、伦理、免疫排斥反应等。MSCs外泌体参与细胞通讯，维持微环境的稳态，促进细胞的增殖、迁移及细胞外基质的修复再生，且能够在不同物种之间传递，却不会引起明显的免疫反应，在组织器官的修复与再生方面表现出巨大潜力。笔者就MSCs外泌体的特征、提取、鉴定及其在脊髓、皮肤、骨、肌腱和神经等组织器官创伤修复再生方面应用的研究进展作一综述，为临床应用MSCs外泌体修复组织器官提供参考。

目的:探讨间质干细胞成骨过程中外泌体转运的miRNA-222-5p对肌腱细胞损伤的修复作用及其机制。方法:收集、分离和鉴定间质干细胞外泌体。小鼠跟腱切断后1周安乐死后取其肌腱，分离培养肌腱细胞，得到肌腱细胞损伤模型（损伤组）；将成骨分化过程中的间质干细胞与肌腱细胞共培养（共培养组）；将miRNA-222-5p模拟物转染进间质干细胞，成骨分化过程中的间质干细胞与肌腱细胞共培养（miRNA-222-5p组）。通过克隆形成、Transwell观察间质干细胞分泌外泌体及外泌体转运的miRNA-222-5p对肌腱细胞损伤修复的能力；qPCR、Western-blot和荧光染色检测成软骨和成骨相关蛋白的相对mRNA和相对蛋白表达水平；通过Western-blot检测信号通路因子的表达。结果:电镜观察外泌体直径为40~100 nm，形态为典型的杯口状结构。外泌体标志蛋白热休克蛋白70、多配体聚糖结合蛋白1、肿瘤转移抑制因子9、肿瘤转移抑制因子63和肿瘤易感基因101的相对表达量分别为2.56±0.22、2.06±0.42、1.96±0.32、1.94±0.38、1.86±0.33，与正常对照组比较差异均有统计学意义（ P<0.05）。克隆形成试验后细胞群落数量：损伤组（4.00±0.58）个、共培养组（7.25±0.48）个、miRNA-222-5p组（16.00±1.35）个，差异有统计学意义（ F=46.550， P<0.001）。Transwell试验后细胞数量：损伤组（37±4）个、共培养组（78±3）个、miRNA-222-5p组（168±8）个，差异有统计学意义（ F=454.100， P<0.001）。qPCR、Western-blot和荧光染色检测结果显示，与损伤组相比，共培养组细胞中Sry相关HMG盒9、Ⅱ型胶原纤维α1基因、蛋白聚糖、骨形态发生蛋白2、Runt相关转运因子2和骨桥蛋白的mRNA和蛋白质表达量增加；与共培养组相比，miRNA-222-5p组细胞mRNA和蛋白质表达量均增加（ P<0.05）。Western-blot结果显示，与损伤组相比，共培养组核因子κB、细胞外调节蛋白激酶2、信号传导与转录激活因子3、信号传导与转录激活因子5和细胞信号转导分子2的表达水平升高；与共培养组相比，miRNA-222-5p组的表达升高（ P<0.05）。 结论:间质干细胞与跟腱细胞共培养可促进跟腱细胞成骨分化，同时间质干细胞来源的外泌体可通过转运miRNA-222-5p进一步促进跟腱细胞成骨分化。其机制可能与损伤肌腱中信号通路因子核因子κB、细胞外调节蛋白激酶2、信号传导与转录激活因子3、信号传导与转录激活因子5和细胞信号转导分子2的表达上调有关。

肌腱损伤常需手术治疗，能够一定程度上恢复肌腱的结构与稳定性，但往往难以恢复到正常的强度，其主要原因是肌腱自然愈合能力有限，修复后的肌腱不能完全恢复功能。随着对肌腱愈合的研究不断加深，生物学技术为肌腱修复提供了新的方向。当前对肌腱修复的研究热点之一是使用生物辅助物来促进肌腱愈合，这些辅助物包括肌腱干/祖细胞(TSPCs)、生长因子等。笔者就TSPCs和生长因子促进肌腱愈合的作用机制研究进展作一综述，为肌腱损伤的生物学治疗和研究提供参考。

肌腱和腱骨止点损伤是常见的运动损伤，严重影响患者日常活动和生活质量。手术重建是肌腱和腱骨止点损伤的主要治疗手段。但由于修复后的肌腱及腱骨止点结构与原生组织差异较大，手术效果常不理想，易再次撕裂。外泌体是一种内含多种活性物质的脂质双层小囊泡，在细胞间通信中发挥重要作用。其中干细胞外泌体作为一种新兴的无细胞治疗手段，在药物递送、组织工程、退行性疾病等领域中得到广泛研究，但其在肌腱及腱骨止点修复中的作用关注较少。因此，笔者就肌腱及腱骨止点的组织学特点和修复过程、干细胞外泌体对肌腱和腱骨止点的修复作用及机制研究进展进行综述，旨在为肌腱及腱骨止点损伤的基础研究及临床治疗提供新思路。

目的:探讨人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）分泌的外泌体对损伤后肌腱细胞修复的影响及其机制。方法:组织块贴壁法分离并纯化筛选出能稳定传代培养的hUC-MSCs，倒置荧光显微镜观察细胞形态，通过流式细胞术检测hUC-MSCs的免疫表型。应用诱导培养基诱导hUC-MSCs向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化并进行鉴定。运用高速离心法提取MSCs的分泌物外泌体（MSCs外泌体），用Western blot技术和电镜检测外泌体，用PKH67染色荧光法检测外泌体膜融合能力。40只Wistar鼠按随机数字表法分为肌腱损伤组和正常组，每组20只。肌腱损伤组：切断跟腱1周后用100 mg/kg戊巴比妥钠处死，取跟腱组织用胰蛋白酶消化得到损伤肌腱细胞。正常组：不做任何处理直接处死，与损伤组并行处理得到正常肌腱细胞。将外泌体与体外培养的肌腱细胞共培养，12，24，48，72 h后通过细胞计数CCK-8检测肌腱细胞增殖情况。hUC-MSCs外泌体处理细胞24 h后，采用Western blot、qPCR、免疫荧光方法检测外泌体对肌腱细胞转化生长因子-β（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。结果:鉴定了hUC-MSCs，并成功分离hUC-MSCs外泌体。分离培养的MSCs呈梭形，丙氨酸氨肽酶（CD13）、整联蛋白β-1（CD29）、ecto-5'-核苷酸酶（CD73）、胸腺细胞表面抗原（CD90）和内皮素（CD105）呈阳性，人类白细胞DR抗原（HLA-DR）、造血祖细胞抗原（CD34）、白细胞共同抗原（CD45）呈阴性。分离出的外泌体经PKH67染色鉴定证实，在电镜下呈直径30~100 nm的圆盘、内部凹陷结构，Western blot检测高表达移动相关蛋白-1（CD9）和溶酶体相关膜蛋白3（CD63）。处理肌腱细胞后，CCK-8检测12，24，48，72 h细胞活性，结果表明肌腱损伤组显著高于正常组（ P < 0.01），qPCR结果表明肌腱损伤组TGF-β（1.850 ± 0.127）、BMP（2.133 ± 0.398）、FGF（1.610 ± 0.223）、VEGF（2.207 ± 0.059）的mRNA表达显著高于正常组TGF-β（1.004 ± 0.105）、BMP（1.007 ± 0.145）、FGF（1.007 ± 0.140）、VEGF（1.001 ± 0.065）（ P < 0.05），而肌腱损伤组IL-1β（0.102 ± 0.009）、TNF-α（0.130 ± 0.013）的表达显著低于正常组IL-1β（1.004 ± 0.113）、TNF-α（1.006 ± 0.134）（ P < 0.01）。Western blot检测结果与qPCR检测趋势一致。 结论:hUC-MSCs分泌的外泌体通过上调生长因子TGF-β、BMP、VEGF、FGF的表达，抑制炎性因子IL-1β、TNF-α的表达，促进肌腱细胞生长，促进肌腱细胞损伤修复。

目的:探索低强度脉冲超声(LIPUS)促进腱骨界面损伤修复的作用及相关机制。方法:建立大鼠(中南大学动物学部提供)肩袖损伤模型并按照随机数字表法分为LIPUS治疗组和对照组，并在术后3周和5周收取冈上肌肌腱-肱骨头复合体标本，进行组织学、免疫组织化学及生物力学检测，相关统计采用双因素方差分析。体外利用LIPUS刺激巨噬细胞并向M2型诱导，检测M2型巨噬细胞占比，收集巨噬细胞上清液干预骨髓间充质干细胞(BMSCs)，检测其成骨和成软骨分化效果，组间比较采用 t检验。 结果:在大鼠肩袖损伤模型中，术后第5周时LIPUS治疗组的腱骨界面成熟度(13.50±2.47比17.33±1.20， t＝2.605， P<0.05)和生物学力性能均优于对照组(拉断负荷：49.60±6.12比34.27±5.85， t＝4.950；拉断刚度：20.85±2.70比13.82±3.01， t＝3.974， P<0.01)。免疫组织化学提示LIPUS治疗组大鼠肩袖损伤局部M2型巨噬细胞比例高于对照组(0.77±0.11比0.59±0.10， t＝2.582， P<0.05)。体外实验也证实LIPUS组M2型巨噬细胞占比高于对照组(65.77±4.72%比42.50±3.20% t＝7.068， P<0.01)，其上清液促进BMSCs成骨(3.92±0.47比1.0±0.12， t＝10.43， P<0.01)和成软骨(2.25±0.35比1.0±0.25， t＝5.034， P<0.01)分化能力更强。 结论:LIPUS可能通过调节巨噬细胞向M2极化，并影响BMSCs分化，从而有效提高大鼠肩袖损伤模型腱骨界面愈合质量。

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)外泌体对大鼠肌腱损伤的修复效果及其机制。方法:培养hUC-MSC，通过流式细胞仪鉴定其表面标志物，通过特定培养基促使细胞成骨、成软骨、成脂三向分化。使用外泌体分离柱从细胞上清中分离外泌体，并通过透射电镜、外泌体绿色荧光标记染料(PKH67)染色和Western blot鉴定外泌体。40只Wistar大鼠采用手术切除的方法建立跟腱损伤模型，按随机数字表法分为hUC-MSC外泌体组(A组，在损伤部位注射100 μg外泌体)和对照组(B组，在损伤部位注射250 μl生理盐水)，每组20只。术后4周，通过q-PCR、Western blot和免疫荧光检测各组肌腱组织中转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平，通过免疫组化方法检测各组损伤组织中胶原蛋白Ⅲ的表达情况。结果:分离培养的hUC-MSC在倒置显微镜下呈梭形，细胞经成骨分化后，出现立方体结节状结构，茜素红染色阳性。成脂分化后，细胞内部出现脂肪，油红O染色呈红色。成软骨分化后，细胞分泌大量氨基葡聚糖，阿利辛蓝染色强阳性。hUC-MSC外泌体经PKH67染色鉴定证实，在透射电镜下呈圆盘状、内部凹陷结构，Westen blot检测高表达移动相关蛋白-1(CD9)和溶酶体相关膜蛋白3(CD63)。q-PCR结果表明，A组TGF-β(4.887±0.767)、BMP-2(3.079±0.150)、VEGF(3.108±0.508)、FGF-2(4.211±0.522)的mRNA表达水平显著高于B组(分别为1.000±0.062、0.918±0.129、1.004±0.103、1.010±0.169)( P<0.01)，而IL-1β(0.697±0.037)、TNF-α(0.793±0.021)的mRNA表达水平显著低于B组(分别为1.004±0.089、1.006±0.015)( P<0.01)。Western blot检测A组TGF-β(1.434±0.041)、BMP-2(1.798±0.177)、VEGF(1.552±0.113)、FGF-2(1.357±0.039)的蛋白表达水平显著高于B组(分别为1.002±0.032、0.992±0.068、1.007±0.070、0.994±0.051)( P<0.01)，而IL-1β(0.705±0.016)、TNF-α(0.840±0.045)的蛋白表达水平显著低于B组(分别为1.000±0.016、1.003±0.040)( P<0.01)。免疫荧光显示，A组TGF-β、VEGF的阳性表达率与B组差异无统计学意义( P>0.05)，而BMP-2(2.278±0.208)、FGF-2(4.656±0.106)的阳性表达率显著高于B组(分别为0.315±0.101、1.661±0.110)( P<0.05或0.01)，IL-1β(1.677±0.947)、TNF-α(1.520±0.088)的阳性表达率显著低于B组(分别为4.296±0.291、2.373±0.273)( P<0.01)。A组肌腱胶原纤维排列规则且紧密，胶原蛋白Ⅲ的表达较为明显，而B组肌腱胶原纤维排列较为松散伴破损的瘢痕样愈合。 结论:hUC-MSC外泌体可促进大鼠损伤肌腱的修复，可能与其上调生长因子TGF-β、BMP-2、VEGF、FGF-2及胶原蛋白Ⅲ的表达，抑制炎性因子IL-1β、TNF-α的表达有关。

严重肌腱损伤会对普通患者的活动能力和生活质量产生重大影响，同时对职业运动员的职业生涯造成重大打击。目前，手术治疗肌腱损伤并不能获得令人满意的效果。对临床医生而言，肌腱损伤仍具有挑战性。肌腱干/祖细胞（TSPCs）的发现以及对其不断深入研究，为肌腱的修复和再生提供了新的方向，推动了肌腱组织工程的不断发展。本文对TSPCs的特性、老化、分离培养及其在肌腱修复的相关应用进展进行系统归纳整理，并对TSPCs的研究方向进行分析和展望。

目的:探讨单轴、双轴循环拉力对小鼠肌腱源性干细胞(TDSCs)分化的影响，为临床肌腱损伤后的康复治疗提供理论基础。方法:取6～8周龄C57BL/6小鼠10只，无菌条件下暴露双侧后腿至脚掌，显微镜下解剖收集小鼠髌腱和跟腱组织块，体外分离培养细胞，观察第3代细胞的形态特点。(1)取传代至第3代的细胞，采用流式细胞术检测间充质干细胞标志物(CD44、CD90、Sca-1)、内皮细胞标志物(CD34、Flk-1)、造血细胞标志物(CD45)，鉴定细胞是否符合TDSCs特点。(2)取传代至第3代的TDSCs进行成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化培养，分别采用茜素红、油红和阿尔新蓝染料对培养的三系细胞进行染色，鉴定细胞是否具有多向分化潜能。(3)取传代至第3代的TDSCs接种到硅胶底培养皿上，分为双轴循环拉力组、单轴循环拉力组、对照组3组。双轴循环拉力组细胞使用Flexcell ? FX-4000TM柔性基底拉伸加载系统，单轴循环拉力组细胞使用自制拉伸力生物反应器，对照组细胞无拉力。双轴循环拉力组、单轴循环拉力组施加机械负荷组的参数均设置为0.25 Hz、6%的循环拉力，在培养期间进行机械负荷加载，每天加载8 h，共加载6 d。第6天机械负荷刺激结束后，收集3组细胞进行实时荧光定量PCR (qPCR)，检测肌腱、成骨、脂肪和软骨相关转录因子的表达。 结果:显微镜下观察第3代TDSCs形态一致，呈梭形纤维状。(1)流式细胞技术检测结果显示，间充质干细胞标志物CD44、CD90和Sca-1表达阳性、内皮细胞标志物CD34和Flk-1表达阴性、造血细胞标志物CD45表达阴性，符合TDSCs标记鉴定特点。(2)三系分化细胞检测结果显示，提取的细胞成功分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，验证了提取的细胞具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。(3)对照组、单轴循环拉力组、双轴循环拉力组3组间比较，肌腱、成骨、软骨、脂肪相关转录因子的相对表达量差异均有统计学意义( P值均<0.05)。组间两两比较：单轴循环拉力组与对照组比较，肌腱、成骨相关转录因子以及脂肪相关转录因子PPARγ的相对表达均增高，软骨相关转录因子的相对表达均降低，差异均有统计学意义( P值均<0.05)，而脂肪相关转录因子CEB/P的相对表达差异无统计学意义( P>0.05)；双轴循环拉力组与对照组比较，肌腱相关转录因子Scx、Mohawk的相对表达降低，成骨相关转录因子Runx2的相对表达增高、碱性磷酸酶(ALP)的相对表达降低，软骨相关转录因子Sox9相对表达增高、Col2a1的相对表达降低，脂肪相关转录因子的相对表达均增高，差异均有统计学意义( P值均<0.05)；单轴循环拉力组与双轴循环拉力组比较，双轴循环拉力组肌腱相关转录因子Scx、Mohawk、Col1a1的相对表达均降低，成骨相关转录因子ALP的相对表达降低，软骨、脂肪相关转录因子的相对表达均增高，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。 结论:单轴循环拉力诱导TDSCs向肌腱细胞、成骨细胞分化，而双轴循环拉力诱导TDSCs向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。单轴循环拉力的作用下可以促进体外TDSCs向肌腱细胞分化，有利于肌腱组织的再生和损伤后的修复，为临床肌腱损伤后的康复治疗提供了理论依据。

目的:胰升糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)、胃泌素协同促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)转分化的胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells, IPCs)分化。方法:(1)制备IPCs模型：胰十二指肠同源盒1(pancreatic duodenal homeobox 1, Pdx-1)、神经元素3(neurogenin 3, Ngn3)联合V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(V-type tendon fibrosarcoma oncogene homolog A, MafA)共转染BMSCs转分化为IPCs；(2)IPCs分为4组：A组，未诱导组；B组，GLP-1诱导组；C组，胃泌素诱导组；D组，GLP-1联合胃泌素诱导组，高糖培养基培养7 d，RT-PCR检测各组胰岛素2(insulin2)、葡萄糖激酶(GK)、巢蛋白(nestin)、胰升糖素(glucagon)及Pdx-1表达水平，ELISA检测各组胰岛素分泌情况。结果:在高糖条件下培养7 d，各组IPCs形态出现明显变化，逐渐聚集并形成散在细胞团块，联合诱导组形成大型细胞团块，双硫棕染色呈红棕色；各组在诱导第0、3、5、7、9天胰岛素分泌水平逐渐提高，且联合诱导组升高最为明显( P<0.05)；与A组相比，B、D组Insulin2和GK表达明显上调，D组glucagon表达下调，C组Pdx-1表达下调，glucagon表达上调，( P<0.05)；与B组相比，C组insulin2表达下调，glucagon表达水平明显上调，D组insulin2和GK表达水平明显上调，glucagon表达水平下调( P<0.05)；与C组相比，D组Pdx-1、insulin2和GK表达水平明显上调，glucagon表达水平下调( P<0.05)。 结论:GLP-1和胃泌素通过上调insulin2和GK，下调glucagon协同促进IPCs向胰岛β细胞分化。