-
重组人白细胞介素-1受体拮抗剂卡那霉素抗性菌种的构建、表达、纯化及质量鉴定
编辑人员丨2024/7/20
目的 构建卡那霉素抗性的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antago-nist,rhIL-1Ra)菌 种,并进行rhIL-IRa蛋白的表达、纯化及质量鉴定,以降低β-内酰胺抗生素带来的风险.方法 分别以氨苄抗性的质粒rhIL-1Ra(A-rhIL-1Ra)、pET-28a为模板,进行PCR扩增,获得线性化载体和卡那霉素基因片段,经同源重组构建卡那霉素抗性的质粒rhIL-1Ra(K-rhIL-1Ra),测序正确后转化E.coli BL21(DE3),构建重组工程菌,经IPTG诱导表达后,进行CM Bestarose Fast Flow、DEAE Bestarose Fast Flow两步柱层析纯化.收集纯化产物,15％SDS-PAGE、分子排阻高效液相色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography,SEC-HPLC)、反相高效液相色谱法(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测纯度,串联质谱法检测质谱相对分子质量,Western blot法鉴定特异性,报告基因法检测生物学活性,液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)法分析比对产品相关杂质.结果 经菌落PCR及测序鉴定证明质粒K-rhIL-1Ra构建正确.表达的K-rhIL-1Ra蛋白相对分子质量约17 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的30％以上;两步纯化的K-rhIL-1Ra蛋白纯度分别为97％和99％,单体含量分别为99.33％和100％,色谱纯度分别为91.86％和96.96％,质谱相对分子质量与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致,可与小鼠抗人IL-1Ra单抗发生特异性反应;纯化的K-rhIL-1Ra蛋白生物学活性为1.29 × 105U/mg,相关蛋白化学修饰类型与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致.结论 成功构建了 K-rhIL-1Ra菌种,表达并纯化后的蛋白符合rhIL-1Ra的特征和质量标准,为rhIL-1Ra菌种变更及可比性研究奠定了基础.
...不再出现此类内容
编辑人员丨2024/7/20
