猪苓菌核栽培中种苓质量不稳定是影响猪苓菌核品质和产量的关键问题,该文拟对根癌农杆菌介导的猪苓遗传转化体系进行研究,为通过分子育种从而获得优质种苓提供技术保障.采用根癌农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、受体材料、侵染时间、共培养时间和筛选条件对猪苓遗传转化效率的影响,利用潮霉素抗性标记基因、特异引物PCR以及荧光检测方法筛选并检测转化子.结果表明,根癌农杆菌GV3101菌株可对猪苓菌丝进行遗传转化,菌液浓度A600nm=0.6,受体材料猪苓菌丝,侵染30 min,共培养3 d为最佳侵染条件;9 μg·mL-1潮霉素初筛和13 μg·mL-1潮霉素复筛两步筛选法为最优筛选条件.经潮霉素抗性筛选、特异引物PCR检测和荧光检测分析,结果表明外源基因eGFP已转入猪苓菌丝内整合到基因组中并成功表达,在最优条件下,转化率可达到2.3％,遗传转化周期从大于90 d缩短到小于60 d.该研究建立并优化了根癌农杆菌介导的猪苓菌丝遗传转化体系,为解析猪苓生长发育的分子机制及分子育种奠定基础.

当植物遭受昆虫取食、极端天气及人为因素等导致的机械性损伤胁迫后,会迅速在转录及代谢水平上启动一系列的应答机制,引起植物内源激素及次生代谢物含量的变化.该研究以药用模式植物丹参为例,评估机械损伤对药用植物代谢的作用.运用qRT-PCR 及 LC-MS检测叶片损伤刺激下,胁迫响应的茉莉酸类物质(jasmonates,JAs)和丹参酮类成分生物合成基因以及含量的变化情况,得出处理后不同时序叶片与根部在转录和代谢水平上的相关规律,从而探讨丹参对机械损伤胁迫的响应机制.结果显示,机械损伤诱导能够瞬时提高JAs生物合成基因的表达,其中AOC与JAR在诱导后开始上升,在2 h达到最高,AOS与OPR3则在4 h达到最高,与之相应的OPDA、JA及JA-Ile的含量均在2 h达到最高.丹参酮生物合成中二萜合酶基因CPS1与KSL1均在2 h上升至最高,而后修饰CYP450s基因则均在4 h上升至最高,4种丹参酮的含量则均在8 h内呈现持续上升的趋势.该研究为揭示机械损伤对次生代谢积累的研究提供参考,为进一步了解机械损伤胁迫下JAs在增强植物抗性、促进活性成分积累和提高药材品质方面的作用奠定基础.

[目的]为明确几丁质和鞭毛蛋白衍生肽flg22诱导的辣椒幼苗先天免疫生理响应特征,探讨辣椒先天免疫生理响应与辣椒抗多种病害的关系.[方法]以5个四川本地辣椒品种幼苗为试材,鉴定它们对青枯病和疫病病情指数和抗性水平,采用水培法培育幼苗并进行外源几丁质和flg22处理,检测各品种不同诱导时间下幼苗根系生长、气孔孔径、胼胝质沉积、活性氧(ROS)积累和SOD、CAT活性,以及先天免疫相关基因表达量的变化,综合评价其生理响应及其与抗病性关系.[结果](1)各品种幼苗青枯病和疫病病情指数以'川腾10号'最低,抗病性最强,以'本地条椒'最高,抗病性最弱.(2)外源几丁质和flg22抑制了各品种幼苗根系生长速率,诱导离体叶片气孔闭合,促进叶片细胞壁胼胝质沉积加厚,ROS含量持续增加,SOD和CAT活性不断提高.各品种幼苗先天免疫生理响应指标的平均隶属函数值以'川腾10号'最高,'本地条椒'最低,并且平均隶属函数值与疫病、青枯病病情指数均具有显著负相关性.(3)外源flg22和几丁质诱导'川腾10号'幼苗先天免疫相关基因CaWRKY22、CaMAPK7和ChiIV3显著上调表达.[结论]外源flg22和几丁质可诱导辣椒幼苗先天免疫生理响应,且响应程度强弱在品种间存在差异,依据生理响应指标通过隶属函数可综合评价辣椒品种的抗病水平;'川腾10号'的平均隶属函数值最高,多抗性水平最好,这与其先天免疫相关基因CaWRKY22、CaMAPK7和ChiIV3的显著上调表达有关.

[目的]为增强不结球白菜对芜菁花叶病素养(TuMV)的抗性,研究探讨了不结球白菜中BcCHC1蛋白与TuMV之间的相互作用机制.[方法]首先从不结球白菜中鉴定出重链网格蛋白(CHC)基因家族的成员BcCHCs,随后克隆了 1个代表性的CHC1基因,并对其进行了亚细胞定位分析.通过双分子荧光互补实验(BiFC)筛选出与BcCHC1蛋白相互作用的TuMV蛋白,并利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)来沉默BcCHC1基因,以评估其功能.[结果](1)成功克隆了不结球白菜的BcCHC1基因,该基因的编码序列长5 124碱基对,编码1 708个氨基酸.(2)在TuMV感染不结球白菜30 d后,实时荧光定量PCR分析显示,感染TuMV的不结球白菜中BcCHC1基因的表达量显著降低.(3)亚细胞定位研究表明,BcCHC1蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞膜和细胞核.(4)BiFC实验进一步证实,BcCHC1蛋白能够与TuMV的CI和6K2蛋白发生相互作用,其中与CI的互作主要发生在细胞核内,而与6K2的互作则主要位于细胞膜.(5)通过对BcCHC1基因沉默株系的观察发现,沉默Bc-CHC1基因会导致植株死亡.[结论]BcCHC1蛋白通过与TuMV的CI和6K2蛋白相互作用,影响网格蛋白依赖的内吞作用途径及病毒复制,从而调控TuMV对不结球白菜的侵染.然而,BcCHC1基因调控TuMV侵染不结球白菜的具体机制仍需进一步研究.

[目的]探究马铃薯磺肽素基因StPSK4特征及其在马铃薯抗病性中的功能分析,为马铃薯抗病育种提供理论依据.[方法]用生物信息学技术对StPSK4进行系统分析,转录组测序分析StPSK4的组织特异性、生物胁迫和非生物胁迫处理下的表达模式,检测StPSK4过表达植株对植物先天免疫反应情况和对青枯菌的敏感性.[结果]StPSK4基因的cDNA全长457 bp,编码100个氨基酸;StPSK4含有信号肽,其高级结构多由α-螺旋和无规则卷曲组成;PSK4的C端含有磺肽素序列DYIYTQ,StPSK4与茄科作物相似性均在80％以上;StPSK4在马铃薯芽和叶柄中高表达,对非生物胁迫(高温、盐)和生物胁迫(青枯菌、疮痂病菌)等响应剧烈;构建并获得过表达StPSK4的转基因马铃薯植株;过量表达StPSK4抑制马铃薯的ROS爆发、防御标记基因表达和对青枯病的抗病性.[结论]StPSK4可以响应高温和青枯病等多种逆境胁迫,过表达StPSK4抑制马铃薯的活性氧爆发、防御标记基因表达和对青枯病的抗性,证实StPSK4抑制马铃薯的抗病功能.

目的:观察抗性糊精对高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂肪沉积及肝脏AMPK通路的影响。方法:取4周龄雄性C57BL/6小鼠36只，随机分为3组，即正常对照组，高脂饮食组和高脂饮食＋抗性糊精组(10 g·kg －1·d －1)。第12周末处死小鼠，留取血清测定三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平；留取肝脏组织，测定TG含量，并予HE和油红O染色，观察肝细胞脂肪变性和肝脏脂肪沉积；实时荧光定量PCR检测肝脏组织脂肪酸合成相关基因SREBP1、ACC、SCD1 mRNA的表达水平，Western印迹检测肝脏pAMPK、SREBP1、Fasn、ACC蛋白的表达。 结果:与正常对照组相比，高脂饮食组小鼠体重增加更显著，空腹血糖(FBG)、血清TC、LDL-C、HDL-C、ALT水平均升高( P<0.01)，血清AST也升高( P<0.05)；肝脏油红O染色可见肝脏组织脂肪沉积明显，肝脏TG含量增加( P<0.01)；SREBP1、ACC mRNA水平升高；pAMPK蛋白水平表达下降( P<0.05)。与高脂饮食组相比，抗性糊精组小鼠体重增加较少，血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT水平较低( P<0.01)，FBG降低( P<0.05)；肝脏油红O染色可见肝脏脂肪沉积减少，肝脏TG含量降低( P<0.01)；SREBP1、ACC、SCD1 mRNA水平下降；pAMPK水平增加，Fasn蛋白水平下降( P<0.01)。 结论:抗性糊精可以改善高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂肪沉积，这一作用可能与激活AMPK通路有关。

目的:研究Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)在鲍曼不动杆菌致病性和耐药性中的作用。方法:收集2016年1月1日至12月31日温州医科大学附属第一医院分离自血流感染患者血液标本的45株鲍曼不动杆菌株，采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪测定其对抗菌药物的敏感性，通过聚合酶链反应检测菌株T6SS主要效应蛋白编码基因溶血素调节蛋白的携带情况，对T6SS阳性鲍曼不动杆菌和T6SS阴性鲍曼不动杆菌分别进行生物膜形成能力检测、抗血清试验和体外竞争试验，收集并分析鲍曼不动杆菌血流感染患者的临床资料及转归情况。统计学分析采用 t检验、秩和检验和 χ2检验。 结果:45株鲍曼不动杆菌中24株T6SS阳性，阳性率为53.3%。T6SS阳性鲍曼不动杆菌对头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素和头胞吡肟的耐药率分别为95.8%、95.8%、66.7%、95.8%、79.2%、95.8%、79.2%和91.7%，高于T6SS阴性鲍曼不动杆菌的28.6%、28.6%、28.6%、28.6%、9.5%、23.8%、23.8%和28.6%，差异均有统计学意义( χ2＝22.12、22.12、6.51、22.12、21.83、24.72、13.79、18.97，均 P<0.05)。T6SS阳性鲍曼不动杆菌的生物膜形成能力、血清抗性和竞争能力均高于T6SS阴性鲍曼不动杆菌，差异均有统计学意义( t＝4.99、 Z＝－2.61、 Z＝－2.27，均 P<0.05)。重症监护病房(intensive care unit，ICU)来源鲍曼不动杆菌的T6SS阳性率为80.0%(16/20)，高于非ICU来源菌株的32.0%(8/25)，差异均有统计学意义( χ2＝10.29， P<0.05)，但鲍曼不动杆菌是否携带T6SS对患者病死率的影响差异无统计学意义( χ2＝1.74， P＝0.188)。 结论:T6SS阳性鲍曼不动杆菌具有较高的致病性，且其高耐药率使得治疗较困难，亟需引起临床医师尤其是ICU医师的高度重视。

目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA)，将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞，利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 －/－ Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 －/－ Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株，HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达，HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较，差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15， t＝0.17， P>0.05)，但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%， t＝5.62， P<0.01]；KP感染HMGB2 －/－ Raw264.7，促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml， t＝5.00， P<0.01；(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml， t＝3.36， P<0.01；(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml， t＝3.68， P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株，验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

目的:以拥有不同抗菌药物耐药性的幽门螺杆菌( H. pylori)临床菌株为研究对象，基于全基因组测序探索 H. pylori对克拉霉素和左氧氟沙星(LVX)耐药相关新基因。 方法:纳入2016年9月1日至2019年8月31日在香港大学深圳医院消化及肝脏科因上消化道相关症状就诊且 13C尿素呼气试验阳性的1 749例患者，在行胃黏膜活体组织检查后进行胃黏膜组织 H. pylori分离培养，成功保存 H. pylori菌株90株。依据体外药敏试验结果，分别筛选克拉霉素单耐药(克拉霉素组)10株，LVX单耐药(LVX组)10株，克拉霉素和LVX双重耐药(双重耐药组)10株，克拉霉素、LVX、阿莫西林、呋喃唑酮、四环素、甲硝唑全敏感(全敏感组)10株，总计40株 H. pylori菌株。通过全基因组测序，与综合抗性基因数据库(CARD)进行比对，分析单核苷酸变异(SNV)和插入缺失突变情况，筛选 H. pylori对克拉霉素和LVX耐药相关基因并分析耐药相关新基因在4组间的表达差异。统计学方法采用独立样本 t检验、单因素方差分析、最小显著差数法和卡方检验。 结果:克拉霉素组、LVX组、双重耐药组、全敏感组SNV位点数[(74 952.00±8 755.21)、(77 128.10±3 191.35)、(78 639.90±601.23)、(77 474.60±2 421.05)个]和插入缺失突变数[(2 582.20±265.45)、(2 653.60±108.37)、(2 667.10±43.82)、(2 641.10±80.25)个]比较差异均无统计学意义(均 P>0.05)。与CARD进行比对，共检出223个耐药相关基因，其中克拉霉素组克拉霉素单耐药相关基因19个，LVX组LVX单耐药相关基因24个，双重耐药组中有克拉霉素单耐药相关基因16个，LVX单耐药相关基因14个，双重耐药相关基因12个；全敏感组中有克拉霉素单耐药相关基因11个，LVX单耐药相关基因17个，双重耐药相关基因13个。克拉霉素单耐药相关基因中，红霉素酯酶基因( ere)B在克拉霉素组、LVX组、双重耐药组、全敏感组的检出率(0/10、0/10、3/10、0/10)比较差异有统计学意义( χ2＝5.79， P＝0.049)；红霉素核糖体甲基化酶基因( erm)家族在克拉霉素组和双重耐药组中的检出率高于LVX组和全敏感组[45.0%(9/20)比10.0%(2/20)]，差异有统计学意义( χ2＝6.14， P＝0.013)，游离甲硫氨酸-(R)-亚砜还原酶基因( msrC)在克拉霉素组、LVX组、双重耐药组、全敏感组检出率(10/10、7/10、6/10、4/10)比较差异有统计学意义( χ2＝8.97， P＝0.030)。LVX单耐药相关基因中，喹诺酮抗性五肽重复蛋白基因( qnr)家族在LVX组和双重耐药组的检出率高于克拉霉素组和全敏感组[60.0%(12/20)比25.0%(5/20)]，差异有统计学意义( χ2＝5.01， P＝0.025)； qnrB4在克拉霉素组、LVX组、双重耐药组、全敏感组检出率(1/10、3/10、7/10、1/10)比较差异有统计学意义( χ2＝10.17， P＝0.010)。4组中克拉霉素单耐药相关外排转运的基因个数少于LVX单耐药和双重耐药相关基因个数(11个比29个，11个比23个)，差异有统计学意义( χ2＝11.87、5.80， P＝0.001、0.016)。LVX相关外排转运基因在克拉霉素、LVX组、双重耐药组、全敏感组检出个数(28、40、24、27个)比较差异有统计学意义( χ2＝10.26， P＝0.016)。 结论:erm家族和 msrC可能是介导 H. pylori对克拉霉素耐药的重要基因， qnr家族与介导 H. pylori对LVX耐药相关。外排转运基因可能在药物外排过程中有协同作用，其更倾向介导 H. pylori对LVX耐药。

目的:探讨雌激素受体(ESR1)对乳腺癌细胞辐射抗性的影响及分子机制。方法:在雌激素受体阴性乳腺癌细胞中转染ESR1过表达质粒(过表达对照vector组、过表达ESR1 OE组)，在雌激素受体阳性乳腺癌细胞中通过慢病毒转染方法构建稳定敲低ESR1(敲低对照shNC组、敲低shESR1组)的细胞模型，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)和免疫印迹方法检测自噬相关基因mRNA(ATG5)和蛋白表达水平(LC3B-I、LC3B-II、P62、FIP200、ATG5、ATG7、ATG12、Beclin1、ULK1)；在8 Gy X射线的电离辐射处理下，免疫印迹法检测自噬通量；采用流式细胞术检测细胞死亡；采用集落形成实验检测乳腺癌细胞辐射敏感性(未照射sham组、照射IR组、电离辐射联合铁死亡抑制剂处理Fer-1＋IR组、电离辐射联合凋亡抑制剂处理Z-VAD＋IR组、电离辐射联合自噬抑制剂处理CQ＋IR组)；用台盼蓝染色检测自噬基因敲低和过表达细胞模型以及雌激素受体抑制剂他莫昔芬(TAM)与电离辐射联合治疗下乳腺癌细胞的死亡率(他莫昔芬未处理TAM－组、他莫昔芬处理TAM＋组)。结果:在8 Gy X射线照射后24 h处理条件下，雌激素受体阳性乳腺癌ZR75细胞ESR1的敲低促进细胞死亡( t＝3.49、3.13, P < 0.05)，而雌激素受体阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞ESR1的过表达抑制细胞死亡( t＝4.16、7.48, P < 0.05)；与单纯照射相比，自噬抑制剂氯喹的处理后增加了敲低ESR1的ZR75细胞集落形成数量( t＝8.49, P < 0.05),抑制自噬可以减少沉默ESR1所致的ZR75细胞死亡。在电离辐射处理下，MDA－MB－231细胞过表达ESR1促进了细胞保护性自噬；ZR75细胞敲低ESR1后细胞保护性自噬降低。在ZR75细胞中敲低ATG5发现自噬降低，细胞死亡增加( t＝4.19、6.39, P < 0.05)，而在ZR75中过表达ATG5可以逆转因敲低ESR1导致的细胞死亡增加( t＝1.70、4.65, P < 0.05)。化疗药物他莫昔芬处理雌激素受体阳性乳腺癌细胞ZR75后发现自噬基因ATG5、ATG12的表达下降，自噬抑制，细胞死亡增加( t＝18.70, P < 0.05)，电离辐射处理促进了这一进程( t＝16.82, P < 0.05)。 结论:雌激素受体ESR1通过增加ATG5自噬相关蛋白，促进雌激素受体阳性乳腺癌细胞的保护性自噬，从而导致雌激素受体阳性乳腺癌细胞的辐射抵抗，化疗药物他莫昔芬联合电离辐射治疗增加了雌激素受体阳性乳腺癌细胞的辐射敏感性。