目的:研究历代本草方剂文献中蜘蛛的药用和食用资源及其临床配伍方法的历史沿革变化,通过完善补充相关资料,为开展蜘蛛的资源利用和新药开发提供有益的借鉴.方法:查阅历代的本草典籍,结合笔者的调查情况,并将国内所使用药用和食用蜘蛛种类及其临床应用方剂进行整理、归纳.结果:国产食用和药用蜘蛛种类共8科18种,按照个体大小分为中小型蜘蛛和大型蜘蛛,前者种类6科14种,中药中应用较为广泛;后者种类有2科4种,富含蜘蛛毒素,在黎族医药中应用广泛,是今后蜘蛛药物开发的主要源泉;蜘蛛药材加工炮制方法和入药部位多样,临床配伍用于治疗疝气、止痛、风湿、痈疽恶毒、无名诸疡、内外痔、腋臭等;可研末内服,浸酒或入丸、散,外擦或捣敷等.此外,少数民族食用蜘蛛主要有7种,常去头足,油炸或烧烤.结论:今后应拓展大型药用和食用蜘蛛资源,综合利用蜘蛛各部位和化学成分,精心组织对经典方剂和少数民族药物应用知识的筛选开展研究,并结合现代生物技术,为蜘蛛资源的现代开发奠定坚实基础.

为建立一种简便、快速且能大量获得富含二硫键的蜘蛛多肽毒素JZTX-26 (35 aa)和JZTX-51 (27 aa)的有效方法,利用PCR的方法克隆成熟肽编码基因并插入至大肠杆菌Escherichia coli表达载体pMAL-p2x中与MBP(麦芽糖结合蛋白)标签融合,构建重组表达质粒pMAL-jz26和pMAL-jz51.在受体菌TB1和BL21 (DE3)中对两个重组表达质粒分别进行IPTG诱导表达,通过Amylose亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE分析;采用因子X对融合蛋白进行酶切后通过分子筛以及反相高效液相色谱对两种重组蛋白进行纯化.通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,表达产物的分子量与预期的多肽理论分子量一致.1L表达培养液中能获得大约5 mg纯化的目的蛋白JZTX-26或JZTX-51.结果表明利用该原核表达体系可对蜘蛛毒素基因jztx-26和jztx-51进行融合表达,并对重组蛋白进行亲和层析,为采用基因工程的手段大量获得蜘蛛多肽毒素奠定了基础.

抑制剂胱氨酸结(inhibitor cystine knot,ICK)多肽是胱氨酸结(cystine knot,CK)多肽的三大家族成员之一.这种类型的多肽合有反向平行的3个β折叠,由3对二硫键形成稳定的拓扑学打结.它们广泛地分布在动物、植物、真菌甚至原核生物中,具有蛋白酶抑制剂,离子通道毒素以及抗微生物、抗疟疾及抗病毒活性等多种生物学功能.本文首先总结了昆虫中已发现的抗微生物活性和离子通道毒素活性的ICK肽;然后介绍了有毒动物尤其是蜘蛛、蝎子,以及植物中一些神经毒素活性的ICK肽,它们通常靶向昆虫体内的各种离子通道,从而发挥杀虫效果;最后结合ICK肽的基因序列特征,结构域和二硫键数目以及物种分布,对其进化多样性进行了探讨.

目的 观察AMPA受体亚基Glu R2 (AMPA-Glu R2) 在脊髓损伤 (SCI) 前后少突胶质前体细胞 (OPC) 中的表达, 明确AMPA-Glu R2在OPC凋亡中的作用.方法 采用胰酶消化法分离并培养原代新生大鼠OPC, 建立SD大鼠SCI模型并获取受损脊髓组织.实验分为对照组、SCI组及谷氨酸受体拮抗剂2, 3-二羟基6-硝基7-氨磺基苯基喹恶啉 (NBQX) 组和蜘蛛毒素 (JSTX) 组.对照组将OPC与正常脊髓组织共培养48 h, 其余组将OPC与受损脊髓组织共培养48 h.NBQX组和JSTX组在加入受损脊髓前分别用NBQX (100μmol/L) 、JSTX (1μmol/L) 处理OPC 10 min后更换正常培养基培养.采用免疫细胞化学染色法和蛋白质印迹分析法检测对照组和SCI组AMPA-Glu R2表达量, 采用流式细胞术检测各组OPC凋亡情况.结果 AMPA-GluR2在OPC细胞膜和细胞质均有表达.SCI组OPC中AMPA-GluR2的表达量较对照组明显降低, 差异有统计学意义 (P <0.05) ;NBQX组及JSTX组AMPA-GluR2的表达量与对照组相当, 均明显高于SCI组, 差异有统计学意义 (P <0.05) .与对照组相比, SCI组OPC凋亡率升高;与SCI组相比, NBQX组和JSTX组OPC凋亡率下降;差异均有统计学意义 (P <0.05) .结论 SCI诱发的OPC凋亡与AMPAR-GluR2的表达下降有关.

目的:研究蜘蛛毒素口腔溃疡散对口腔溃疡(RAU)模型大鼠的治疗作用及其机制.方法:采用纸片扩散法检测该散剂的体外抑菌活性.取50只健康SD大鼠,随机分为正常组、模型组、阳性组(桂林西瓜霜,100 mg/kg)和口腔溃疡散高、低剂量组(70、35 mg/kg),每组10只.除正常组外,其余组大鼠均采用醋酸法在其右侧口腔黏膜建立RAU模型.模型成功建立后,各给药组大鼠分别以相应药物涂抹溃疡处,连续给药3d;正常组和模型组不作处理.观察给药第1、3天时大鼠溃疡面情况并测定溃疡面积;取部分溃疡组织切片观察其组织形态学变化;检测大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6、干扰素γ(IFN-γ)的水平;采用免疫组化法检测大鼠溃疡组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)、核因子κB(NF-κB)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)的蛋白表达水平.结果:口腔溃疡散体外抑菌效果明显.与空白组比较,模型组大鼠口腔溃疡明显,组织病变明显;血清中TNF-α、IL-1、IL-6、MDA水平均显著升高,IFN-γ、SOD、GSH水平均显著降低(P<0.01);溃疡组织中MMP-9、NF-κB、Caspase-3、PARP表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01).与模型组比较,口腔溃疡散各剂量组大鼠的溃疡面积均显著缩小(P<0.05或P<0.01)或几近愈合,组织病变明显减轻;血清中MDA、TNF-α、IL-1、IL-6水平均显著降低,SOD、GSH、IFN-γ水平均显著升高(P<0.05或P<0.01);溃疡组织中MMP-9、NF-κB、Caspase-3、PARP表达水平均显著降低(P<0.01).结论:蜘蛛毒素口腔溃疡散具有强效的抑菌、消肿、修复作用,对RAU模型大鼠有明显的治疗作用;其机制可能与降低炎症因子水平、介导凋亡因子的表达、调节免疫失衡有关.

对颜氏大疣蛛Macrotheleyani蛛毒所富含的多肽与蛋白质多样性进行探索,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱技术分离和鉴定颜氏大疣蛛蛛毒中的蛋白质和多肽,并对其相对分子质量分布多样性进行分析.结果 显示:粗毒中所含蛋白质的相对分子质量主要分布在35 kDa以上.在17～ 135 kDa分离度较佳的共有11条电泳条带,主要集中于40 ～ 120 kDa附近;在75 kDa附近弥散着高丰度的蛋白条带,75 kDa以上的蛋白质最丰富.粗毒经色谱分离后得到超过50个色谱峰,经质谱鉴定得到121个物质成分,其中,多肽类物质的相对分子质量呈双峰式分布,21％分布在500～2 000 Da,76％分布在3000～5000 Da,为粗毒中多肽含量最丰富的部分,且集中于35 ～ 60 min的保留时间内被洗脱.研究结果表明,颜氏大疣蛛蛛毒中含有较为丰富的多肽和蛋白类物质,这些物质的相对分子质量分布特征与已报道的其他蜘蛛既有相似性又存在具体差异.本文展示了颜氏大疣蛛蛛毒的分子多样性,为后续该毒素的物质基础研究及药用价值开发提供参考.

目的 探讨有氧运动联合HWTX-Ⅰ介导Keap 1-Nrf2-ARE途径对Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO1的影响,以及在阻塞性黄疸小鼠中枢神经系统损伤中的保护作用.方法 50只雄性KM小鼠随机分为5组,10只/组:空白组(GO),模型组(M),有氧运动组(T),HWTX-Ⅰ组(H),有氧运动联合HWTX-Ⅰ组(TH).M组、T组、H组、TH组小鼠均采用手术线直角悬挂阻断胆总管72 h构建阻塞性黄疸模型.通过有氧运动及尾静脉注射HWTX-Ⅰ(0.05 μg/g)进行干预,采用一般行为学观察及Clark神经功能评分、ELISA酶联免疫、脑组织nissl染色、海马组织Western blot检测、mRNA检测及肝组织mRNA表达谱测序分析,探讨有氧运动及HWTX-Ⅰ对阻塞性黄疸小鼠脑组织中枢神经损伤的改善效果.结果 M组胆总管悬挂72 h后出现明显黄疸症状,皮肤局灶黄染面积增大,尿液变黄及粪便呈浅灰色,Clark神经功能评分显著升高(P＜0.01);与M相比,T组、H组、TH组血清肝功能指标ALT、AST、TBIL和TBA含量水平下降(P＜0.01),海马组织5-HT、BDNF含量上升,S100B、NSE含量下降(P＜0.01),上述除肝功能指标外,有氧运动与HWTX-Ⅰ间均存在协同效应.镜下显示,M组脑组织皮质神经细胞尼氏小体大量丢失,有明显空泡、深染,大量核固缩、核坏死.T组、H组针对上述症状明显改善,TH组干预效果最佳.相比M组,T组、H组、TH组脑组织中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表达及蛋白表达水平显著升高(P＜0.01,P＜0.05),且有氧运动与HWTX-I间均存在协同效应.Illumina高通量测序筛选肝组织神经相关因子及关联分析显示,差异表达因子主要富集于神经活性配体-受体相互作用、GABA能突触、多巴胺能突触、突触小泡循环及轴突指导等神经调控通路,涉及组织细胞神经细胞信号转导、凋亡抑制、免疫反应、毒性等,有氧运动与HWTX-I可显著增加神经元损伤修复、增殖等相关信号通路的富集.且有氧运动与HWTX-I间均存在协同效应.结论 7周有氧运动或HWTX-I尾静脉注射可通过Keap1-Nrf2-ARE途径上调Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO1的表达,增强机体阻塞性黄疸后脑组织中枢神经的保护作用,且有氧运动与HWTX-I联合应用效果最佳.

富含二硫键毒素多肽广布于蝎、胡蜂、蜘蛛、海葵、蜈蚣、芋螺与蛇等有毒动物毒液中,具有抗菌、抗肿瘤、镇痛、抗血栓、抑制或激活离子通道等多种生物学活性[1-3].基于二级结构差异,这类多肽可分为四类:(1)α螺旋/β折叠,如BmKTX[4];(2)α螺旋,如K-hefutoxin[5];(3)β折叠,如TRTX-Hhn2b[6];(4)无规卷曲,如ImKTx104[7](图1).其共同特征是含多对二硫键,而二硫键的正确形成是其发挥正常生物学功能的前提.

间斑寇蛛Latrodectus tredecimguttatus的一个显著特点是其毒腺外组织甚至卵粒中也存在毒性成分.研究毒腺外的毒素不但可以加深对蜘蛛毒素的了解,而且可以发现具有重要应用前景的新型毒素分子.为了探究间斑寇蛛卵粒中低丰度表达的蛋白质类毒素,利用生物信息学方法从间斑寇蛛卵粒转录组中挖掘出一条编码多肽毒素的基因序列,利用基于3'-RACE和巢式PCR的策略成功克隆并异源表达了该基因.表达的多肽毒素命名为间斑寇蛛卵粒毒素-Ⅵ(Latroeggtoxin-Ⅵ,LETX-Ⅵ).生物学活性鉴定结果表明,LETX-Ⅵ能抑制ND7/23细胞膜上的钠离子通道电流和促进PC12细胞多巴胺的释放,但对美洲蜚棟Periplaneta americana和金黄色葡萄球菌及白色念珠菌等细菌和真菌不显示明显的毒性,说明LETX-Ⅵ是一种哺乳动物特异的神经毒素,在神经生物学研究工具试剂和相关疾病治疗药物的研发等方面具有潜在的应用前景.

蜘蛛来源于野生动物资源,其毒素和蜘蛛丝均具有较强的生物学活性,在生物学领域和材料工程领域应用广阔.本文对国内外蜘蛛毒素及蜘蛛丝的结构及药理作用研究文献进行了总结分析,综述了近年来蜘蛛毒素在对离子通道的作用、神经保护、抗肿瘤、抗菌及对酶活性作用等方面的研究进展,蜘蛛丝在促凝血、神经修复、作为复合载体方面的应用.为今后蜘蛛毒素及蜘蛛丝的进一步研究提供参考,为发展人工养殖及新药研发打下基础.