在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中.然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一.为提高 CRISPR/Cas9 系统介导的 HDR 效率,本团队及前人研究将不同接头蛋白与SpCas9 蛋白融合表达,利用其与特异性 DNA 序列结合的特性,构建了多种 CRISPR/SpCas9 供体适配基因编辑系统.为了便于比较、优化不同CRISPR/Cas9 供体适配系统,本研究利用这些系统在HEK293T细胞GAPDH和ACTB基因末位外显子 3′-端进行了eGFP基因敲入,并采用了优化的供体DNA模板设计方式,通过PCR和Sanger测序检测敲入的准确性,流式细胞分析进行敲入效率的检测.结果表明,将yGal4BD、hGal4BD、hLacI、hTHAP11 和 N57 等接头蛋白与 SpCas9 蛋白 C-端融合对其活性均无显著性影响;在 GAPDH位点上,SpCas9融合yGal4BD、hGal4BD、hLacI和hTHAP11的供体适配系统等均能显著提高敲入效率;在ACTB位点上,SpCas9融合yGal4BD和hGal4BD能显著提高敲入效率;且增加供体DNA模板中的结合序列(binding sequence,BS)数量,有利于提高SpCas9-hTHAP11 系统介导的敲入效率.总之,本研究比较并优化了不同的CRISPR/Cas9 供体适配基因编辑系统,为后续相关的基因编辑应用研究提供了参考和借鉴.

目的:研究哮喘中线粒体自噬相关基因(mitochondrial autophagy-related gene,MRG)表达情况、构建疾病预测模型,根据MRG特征对哮喘进行分型并挖掘可能的潜在靶标与治疗药物.方法:基因表达综合数据库中获得哮喘气道上皮转录组学数据,筛选出差异表达MRG,并在哮喘小鼠气道上皮及白介素(interleukin,IL)-13刺激的小鼠原代气道上皮细胞模型中行免疫组化验证;运用机器学习算法构建哮喘预测模型,根据MRG表达谱分型,基因本体论及京都基因与基因组百科全书分析生物学功能及相关信号通路差异;药物基因组学数据库筛选可能的靶向药物.结果:哮喘患者MRG整体表达较健康受试者显著升高,差异最显著基因为线粒体外膜转位酶5(translocase of outer mitochondrial membrane 5,TOMM5),其在哮喘患者、哮喘小鼠气道上皮细胞及IL-13刺激的小鼠原代上皮细胞模型中表达均上调;22个MRG中筛选出7个疾病最相关特征基因(TOMM5、FUN 14结构域蛋白1、线粒体外膜转位酶22、自噬接头受体蛋白1、磷酸甘油酸变位酶5、线粒体融合蛋白2及核糖体蛋白S27a),并以此构建哮喘预测模型,受试者工作特征曲线评估显示预测性能良好;共识聚类分析将哮喘分为2个亚型,两型在基因表达及通路富集方面均存在显著差异;不同分型靶向小分子药物的预测结果分别为XMD8-92和Verrucarin-A.结论:上述7个MRG可作为哮喘预测的有效分子标志物,研究结果有望为患者疾病分型及个体化治疗提供新的参考依据.

目的 探讨利拉鲁肽对百草枯(PQ)诱导的帕金森病(PD)小鼠模型保护作用以及作用机制.方法 24只昆明种小鼠随机分为对照组、PQ组、PQ+利拉鲁肽组,每组8只.通过连续5 d腹腔注射PQ(10 mg/kg)复制PD小鼠模型,连续7 d腹腔注射利拉鲁肽(50nmol/kg)进行干预.采用行为学方法检测小鼠自主活动能力;免疫荧光观察酪氨酸羟化酶(TH)、离子钙接头蛋白分子1(Iba1)阳性细胞数;Western blotting检测TH、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、线粒体融合基因2(Mfn2)、线粒体动力相关蛋白1(Drp1)蛋白的表达.结果 与对照组相比,PQ组站立次数极显著减少(P＜0.01),活动次数显著减少(P＜0.05),黑质TH阳性细胞数、TH蛋白表达极显著减少(P＜0.01),Iba1阳性细胞数、GFAP蛋白表达极显著增加(P＜0.01),Drp1蛋白表达显著增加(P＜0.05),Mfn2蛋白表达显著降低(P＜0.05).经利拉鲁肽干预后,与对照组相比,PQ+利拉鲁肽组TH阳性细胞数显著降低(P＜0.05);与PQ组相比,PQ+利拉鲁肽组小鼠站立次数、活动次数显著增加(P＜0.05),TH阳性细胞数、TH蛋白表达极显著增加(P＜0.01),Iba1阳性细胞数极显著减少(P＜0.01),GFAP蛋白表达显著减少(P＜0.05),Drp1蛋白表达极显著减少(P＜0.01),Mfn2蛋白表达极显著增加(P＜0.01).结论 利拉鲁肽能减轻PQ诱导的PD模型小鼠黑质神经炎症,调节线粒体融合、分裂,减少多巴胺能神经元的丢失,具有神经保护作用.

目的:分析蛋白EgG1Y162-2通过不同长度接头序列连接后形成的肽段四聚体蛋白EgG1Y162-2(4)的氨基酸序列特征,明确其理化性质及三级结构,预测并对比经不同长度柔性接头连接后其优势抗原表位变化,为增强重组疫苗免疫原性选取最理想的linker序列.方法:利用生物信息学方法选择GSGGSG、GGGGSGGG和GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列进行连接设计EgG1Y162-2(4)重组蛋白疫苗.在线软件ProtParam分析其理化性质;SOPMA在线数据库对设计有不同linker序列的重组蛋白二级结构进行预测分析;I-TASSER在线软件预测所设计重组疫苗的三级结构,并使用SYFPEITHI、IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测.结果:经预测通过GSGGSG、GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列连接的EgG1Y162-2(4)均是稳定蛋白且具有亲水性并得到其二级结构特点.设计的重组疫苗EgG1Y162-2(4)通过生物信息学方法预测得知通过GSGGSG连接的EgG1Y162-2(4)中α螺旋占8.50%,β-转角占16.67%,无规则卷曲约占40.48%,延伸链约占34.35%,该蛋白有8个T/B联合表位,前后串联的EgG1Y162-2蛋白不仅能够正常折叠,且与EgG1Y162-2蛋白相比T/B抗原表位未发生偏移.三级结构显示通过linker序列GSGGSG串联的4个蛋白EgG1Y162-2均能正常表达,而通过GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG串联的蛋白EgG1Y162-2(4)表位发生了一定程度右移.结论:利用GSGGSG 6个氨基酸连接EgG1Y162-2蛋白构成的EgG1Y162-2(4)的T/B联合表位高度重合,表位未发生迁移说明蛋白EgG1Y162-2(4)通过这种方式连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白优势表位造成影响,并通过重复蛋白表位数增强疫苗免疫应答效果,制备有效的棘球蚴病表位疫苗.

为了充分利用肿瘤细胞表面的一些特异性分子,探寻肿瘤的靶向治疗途径,研发新的肿瘤靶向药物.本研究以去整合素蛋白Salmosin作为载体,MMP-2切割位点氨基酸序列作为接头,蜂毒肽作为毒素分子,构建了rSalmosin-Mel毕赤酵母真核表达载体.通过甲醇诱导rSalmosin-Mel蛋白的分泌表达至培养中,经过QSepharoseHP和Sephadex G-75分离得到纯度大于95％的重组蛋白.体外抗肿瘤活性结果表明,rSalmosin-Mel能浓度依赖性的抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖.进一步研究发现rSalmosin-Mel能诱导MCF-7细胞凋亡,其机制可能与抑制NF-κB蛋白的活化相关.本研究建立了rSalmosin-Mel蛋白的制备工艺,初步阐明了其抑制乳腺癌癌增殖的分子机制.

构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性.根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域.设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒.转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证.鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白.利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定.克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19-393 aa)、NR1-S1(编码394-544 aa)和NR1-S2(编码663-800 aa).其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段.经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒pCold-SUMO-M1和pCold-SUMO-S 1-GT-S2.SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S 1-GT-S2蛋白.对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白.Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应.本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S 1-GT-S2纯化蛋白.该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测.

癌症是严重威胁人类生存的重大疾病.BiTE(bispecific T-cell engager)所代表的一类具有显著抗肿瘤效应的双特异抗体,能够靶向性激活自身T细胞杀伤肿瘤细胞.BiTE由两个单链可变片段(scFv)组成,通过柔性融合接头串联连接.一个scFv识别T细胞表面蛋白CD3ε,而另一个scFv识别特异性肿瘤细胞表面抗原.BiTE的这种结构和特异性结合蛋白能力允许它将T细胞物理性地桥接肿瘤细胞而形成T细胞-BiTE-肿瘤细胞复合物,诱导免疫突触形成,刺激T细胞活化,产生杀伤肿瘤的细胞因子.近年来,BiTE在抗肿瘤研究中取得了显著进展,在临床上取得了理想的治疗效果.因此,对BiTE的结构、作用机制、临床应用以及创新性运用进行阐述.

[背景]L-异亮氨酸(L-isoleucine,L-Ile)和L-别异亮氨酸(L-allo-isoleucine,L-allo-Ile)是自然界中广泛存在的一对同分异构体.抗感染抗生素Desotamides结构中含L-别异亮氨酸结构单元,其生物合成途径中的氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE可以协作催化L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸相互转化.[目的]通过理性设计,使氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE融合表达,研究融合蛋白DsaDE催化异亮氨酸和别异亮氨酸相互转化的功能.[方法]利用PCR分别扩增dsaE基因编码区DNA片段、以及含dsaD基因编码区和114个碱基接头序列的DNA片段dsaD-linker,利用酶切位点KpnⅠ将dsaE和dsaD-linker相连,形成dasDE重组序列,并克隆至pET28a(+)中,将重组质粒pET28a-dsaDE转化至Escherichia coli BL21 (DE3)中进行融合表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白DsaDE;分别以L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸为底物进行融合蛋白的体外酶活性检测,利用高效液相色谱对酶反应产物进行分析.[结果]PCR验证、酶切验证以及测序结果证明pET28a-dsaDE重组载体具有正确序列;N-末端和C-末端融合6个组氨酸标签的融合蛋白DsaDE在E.coli BL21 (DE3)中获得可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析法一步纯化获得纯度约95％的融合蛋白,纯化的融合蛋白DsaDE具有较好的活性,能够催化L-isoleucine和L-allo-isoleucine间的相互转化.[结论]氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE成功融合表达,经一步Ni-NTA亲和层析法纯化即可获得纯度较高的融合蛋白,融合蛋白同时具有氨基转移酶和异构酶的活性,为进一步研究L-别异亮氨酸的工业化生产奠定了基础.

背景与目的:Src羧基末端激酶结合蛋白(Csk-binding protein,CBP)是新近发现的通过棕榈酰化位点锚定脂筏,参与多种肿瘤的发生、发展过程的抑制性跨膜接头蛋白.本研究旨在观察棕榈酰化位点异常的CBP对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其相关的分子机制.方法:构建CBP-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green lfuorescent protein,EGFP)融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立CBP棕榈酰化位点突变的A431细胞系以及CBP过表达的A431细胞系,实验分为4组:空白对照组(Parental组,未进行基因转染的A431细胞)、阴性对照组(Control,A431细胞转染仅含EGFP阴性对照病毒载体)、阳性(过表达)对照组(WT-CBP,A431细胞转染WT PAG1-EGFP病毒载体)、实验组(Mutant-CBP,A431细胞转染棕榈酰化位点突变的CBP-EGFP病毒载体).采用流式细胞术(lfow cytometry,FCM)检测转染率,并用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time lfuorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后细胞中CBP mRNA表达和蛋白水平,验证转染是否成功.采用流式细胞术检测CBP棕榈酰化位点突变对细胞凋亡的影响;细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)细胞增殖实验、划痕、transwell迁移及侵袭实验检测CBP棕榈酰化位点突变对A431细胞生长、迁移和侵袭能力的影响;用Western blot检测Csk和Fyn两种下游信号转导分子蛋白水平的变化.结果:建立了稳定的CBP棕榈酰化位点突变A431细胞系和CBP过表达A431细胞系.采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示,与Control组和Parental组比较WT-CBP组A431细胞的凋亡明显增多,差异有统计学意义(P<0.001);但Mutant-CBP组A431细胞的凋亡与WT-CBP组相比明显减少,与Control组和Parental组比较差异无统计学意义(P>0.05).划痕实验结果表明,与Control组和Parental组比较野生型CBP过表达组A431细胞愈合率明显降低(P<0.001),而CBP棕榈酰化位点突变A431细胞愈合率没有明显变化(P>0.05).Transwell迁移和侵袭实验结果表明,与Control组和Parental组比较野生型CBP过表达组A431细胞的迁移、侵袭能力明显降低(P<0.001),过表达CBP棕榈酰化位点突变A431细胞的迁移和侵袭能力与WT-CBP组相比明显增高,而与Control组和Parental组相比差异无统计学意义(P>0.05).Western blot结果表明:WT-CBP组Csk和Fyn蛋白与Parental组和Control组相比表达明显增加(P<0.001),而Mutant-CBP组Csk和Fyn蛋白的相对表达水平与Parental组和Control组相比,差异无统计学意义(P>0.05).结论:CBP上调可以抑制A431细胞的增殖,但棕榈酰化位点突变的CBP丧失了发挥抑制细胞增殖的功能.由此可见,棕榈酰化位点突变可影响CBP发挥其抑制细胞增殖的作用.

[目的]构建携带小鼠Dok5基因及其PH、PTB结构域的原核表达载体,并表达对应GST融合蛋白.[方法]从小鼠脑组织提取总RNA,逆转录后经PCR扩增、酶切、连接及转化大肠杆菌DH5α,构建携带Dok5全长(FL)、PTB、PH结构域的原核表达质粒,经酶切及测序鉴定之后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达蛋白,再利用Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化得到融合蛋白,并通过Western Blotting检测其与相应抗体的反应性.利用生物信息学相关软件(ClustalW2、ProtParam、ProtScale、NetPhos 2.0 Server、SOPMA、Swissmodel)预测Dok5蛋白的理化性质和磷酸化位点以及二、三级结构.[结果]构建了小鼠Dok5 FL、PH、PTB的原核表达质粒,并得到了浓度分别为0.3mg/ml、0.6 mg/mL、1 mg/mL的pGEX 6p-1-Dok5 FL、PH、PTB蛋白,其中Dok5 FL融合蛋白与相应抗体具有良好的反应性.Dok5长度为921 bp,编码306个氨基酸,在人、鼠、猴中高度保守.Dok5相对分子质量为35.453 kDa,理论pI为9.0,包含50个潜在磷酸化位点.[结论]分别得到了63 kDa、39 kDa、37 kDa的Dok5 FL、PH、PTB的GST融合蛋白,预测Dok5是一种亲水性的不稳定蛋白.