目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA)，将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞，利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 －/－ Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 －/－ Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株，HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达，HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较，差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15， t＝0.17， P>0.05)，但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%， t＝5.62， P<0.01]；KP感染HMGB2 －/－ Raw264.7，促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml， t＝5.00， P<0.01；(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml， t＝3.36， P<0.01；(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml， t＝3.68， P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株，验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

作为新一代的基因编辑技术，规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins，CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能，已被应用于许多领域。目前，已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein, Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测，具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制，以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。

目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增（RAA）和成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas13a）系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列，设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA（crRNA）。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对，并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列，构建了RAA-Cas13a核酸检测体系，通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA，评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）方法同时检测临床菌株，得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA（ t=11.05， P<0.01），且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性，Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法，可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

近年来，异体皮来源极度匮乏，给大面积危重烧伤患者的救治带来了极大挑战。而异种猪皮虽然结构功能与人皮肤相似，但受免疫排斥反应、猪内源性反转录病毒感染等因素影响，其临床应用受到限制。随着基因编辑技术的发展，特别是成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9系统的出现，使一次实施多位点靶基因编辑成为可能，为异种猪皮治疗烧伤创面带来了广阔的应用前景。该文着重对异种猪皮移植治疗临床烧伤创面的进展、存在问题、基因修饰/编辑策略及其应用研究进行讨论。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种利用RNA指导核酸内切酶进行基因编辑的技术，具有操作简便、靶向精准、周期短、基因敲除效率高等特点，被广泛用于多个物种的基因编辑及疾病基因治疗中。目前，采用该技术已构建了多种眼科疾病动物模型，如角膜营养不良模型( UBIAD1、 TGF- β R124C基因突变)、青光眼模型( MYOC Y435H、 OPTN E50K和 PMEL基因突变)、白内障模型( GJA8、 KPNA4、 c- Maf、 AQP5和 PIKFYVE基因突变)、Leber先天性黑矇动物模型( KCNJ13和 LCA5基因突变)、视网膜母细胞瘤动物模型( RB1/ RBL基因突变)和视网膜色素变性动物模型( HKDC1、 C8ORF37、 CERKL、 PRCD、 ASRGL1、 LRAT和 PDE6B基因突变)等。还有研究者采用该基因编辑技术进一步证实了 MFRP、 CPAMD8、 Pax6和 FREM基因在动物眼部发育过程中的作用。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进行综述。

腺相关病毒载体（AAV）是目前最重要的病毒工具，已在基因治疗领域得到广泛应用；因其具有体积小、无包膜、无致病性等特点，故而是治疗遗传性视网膜疾病的主要手段之一。目前针对原癌基因酪氨酸激酶基因治疗视网膜色素变性、ND4基因治疗Leber遗传性视神经病变以及Rab伴随蛋白-1基因治疗无脉络膜症的临床试验均发现约一半的患者视力改善。针对AAV基因治疗Leber先天性黑矇、X连锁视网膜劈裂症、全色盲以及老年性黄斑变性的临床试验也正在开展。而关于Stargardt病、Usher综合征、真性小眼球的AAV基因治疗尚在动物实验或理论阶段。目前AAV基因治疗主要用于隐性遗传性视网膜疾病，对于显性遗传性视网膜疾病需采用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术等来干预。对于遗传性视网膜疾病的治疗，这将是一个重要且复杂的系统性工程，需投入更多人力物力共同参与和研究，期待在不久的将来能有大的突破。

随着分子生物学技术的进步和基因遗传学的发展，病毒载体系统不断地得到改良及优化，并以其特有的优势逐渐成为眼科基因治疗的良好载体之一。目前，多种病毒载体已应用于眼科疾病的基因治疗研究并取得较好成果。腺病毒载体具有瞬时表达的特点，在减轻角膜移植免疫反应等领域发挥重要作用；慢病毒载体具有稳定高效的特点，在体内可长期缓慢表达，为青光眼治疗提供了新的给药方案；腺相关病毒载体具有免疫原性低，精准持久等特点，可感染多种视网膜细胞，其与成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9联合使用，为眼科遗传疾病的精准治疗提供了新的思路。病毒载体的出现大大提高了基因治疗的应用潜力，具有传统疗法不可比拟的优势。相信随着技术的进步，以病毒为载体的基因转导技术将会很快进入临床应用，解决更多的眼科疑难问题。

人诱导多潜能干细胞（hiPSC）可定向分化为眼特定细胞组织，在视网膜细胞移植、角膜移植、晶状体再生等领域有应用前景；成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白核酸酶（CRISPR/Cas9）基因编辑技术可以高效向hiPSC引入眼遗传病特异突变，将携带眼遗传病基因的hiPSC分化为特定的细胞类型，在体外建立眼遗传病模型或建立体外筛选平台寻找治疗性药物，还可纠正基因组中的遗传突变用于细胞治疗。两者的结合正在为眼再生医学及眼遗传病的基因治疗带来革命性的突破。本文对hiPSC的应用及其与基因编辑技术结合在眼相关遗传病的研究展开综述。 （中华眼科杂志，2021，57：712-716）

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因（CRISPR/Cas）系统，作为一种新兴的基因编辑系统，根据Cas蛋白的数量可分为一类系统和二类系统。二类系统中的CRISPR/Cas9仅借助Cas9蛋白和单链向导RNA即可对目标核酸进行切割，是目前应用最为广泛的CRISPR/Cas系统。除了基因编辑在遗传病治疗中的应用，CRISPR/Cas系统衍生出的多种技术在疾病相关基因的筛查、基因表达调控、病原微生物的快速检测和防治等领域也展现了巨大的应用前景。本文就CRISPR/Cas系统的发现历程及其衍生的几个主要技术的应用进行总结，旨在为生命科学领域研究人员提供参考。

目的:构建表达视觉系统同源框2( VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。 方法:根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理，设计 VSX2的小向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒；2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系，采用嘌呤霉素筛选获得单克隆，扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型；采用核型分析法分析报告细胞系核型；采用STR法排除细胞交叉污染；采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达；通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力；应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官，并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。 结果:电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有 VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明，BC1- VSX2 eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明，BC1- VSX2 eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性，包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明，由BC1- VSX2 eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性；eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。 结论:成功构建1株表达 VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs，该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化，为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。