目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA)，将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞，利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 －/－ Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 －/－ Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株，HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达，HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较，差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15， t＝0.17， P>0.05)，但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%， t＝5.62， P<0.01]；KP感染HMGB2 －/－ Raw264.7，促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml， t＝5.00， P<0.01；(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml， t＝3.36， P<0.01；(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml， t＝3.68， P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株，验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

目的:应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法:选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型，设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3，制备AAV，病毒滴度达1～4×10 13 GC/ml；感染WD肝细胞，72 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出其中活性最高者sgRNA1，构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT，应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞，测序和T7E1酶切检测模板修复效率；用HT特异性引物行PCR，验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。 结果:Sanger测序结果显示，sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%]，与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%]，差异有统计学意义( P<0.05)。进一步用HT进行基因修正，能检出特异性修正后的ATP7B基因；二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。 结论:AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

作为新一代的基因编辑技术，规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins，CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能，已被应用于许多领域。目前，已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein, Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测，具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制，以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。

传染性病原体对世界卫生和社会经济的严重影响受到持续关注。现有检测方法存在敏感度和特异性不足、过程繁琐等局限。CRISPR/Cas技术凭借其高特异性、高灵敏度以及可编程性，近年来在感染性病原体的快速检测研究中展现出重要潜力。本文概述了CRISPR/Cas体系中常用的Cas蛋白的功能机制，着重总结了基于CRISPR/Cas系统的新型生物传感技术，及在感染性疾病检测领域中的最新研究进展，并展望了亟待解决的技术问题以及未来发展方向。随着研究的不断深入，基于CRISPR/Cas体系有望实现多样化发展，为POCT在病原体快检领域的应用提供强大的技术支持。

目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增（RAA）和成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas13a）系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列，设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA（crRNA）。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对，并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列，构建了RAA-Cas13a核酸检测体系，通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA，评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）方法同时检测临床菌株，得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA（ t=11.05， P<0.01），且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性，Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法，可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

目的:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术建立多囊肾病1（polycystic kidney disease 1， Pkd1）基因条件敲除小鼠模型，为深入研究 Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用提供动物模型。 方法:采用In-Fusion技术构建打靶载体，根据 Pkd1基因制备对应的gRNA、Cas9 mRNA及携带loxP位点的供体载体，共同注射于C57BL/6N小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经PCR鉴定及测序分析分选出 Pkd1 flox/flox基因型F0代阳性小鼠，后者与野生型小鼠配繁，筛选出后代基因型为 Pkd1 flox/+的F1代杂合子小鼠，内部扩繁获得基因型为 Pkd1 flox/flox的F2代纯合子小鼠，该基因型小鼠再与 Cre阳性表达的 Ggt1- Cre小鼠杂交，获得 Pkd1 flox/+Ggt1 Cre基因型的F3代小鼠，F3代自交或与F2代 Pkd1 flox/flox回交得到 Pkd1 flox/floxGgt1 Cre基因型的F4代小鼠，即肾脏特异性 Pkd1基因敲除（ Ggt1-cKO）小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型，按基因鉴定结果分为野生型对照（WT）组（ n=6）、 Pkd1纯合子对照（PKD）组（ n=6）和 Ggt1-cKO敲除验证（CKO）组（ n=6）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组小鼠肾脏和其他器官组织中 Pkd1 mRNA的表达；HE染色检查各组小鼠肾组织病理改变；自动生化检测仪检测小鼠血清尿素氮和血清肌酐含量，并计算肾脏系数。 结果:PCR检测结果显示，CKO组子代小鼠基因型符合 Pkd1 flox/floxGgt1 Cre。 Pkd1基因仅在肾脏特异性表达，其余组织中均未见表达。RT-qPCR结果显示，CKO组小鼠肾脏髓质 Pkd1 mRNA相对表达量显著低于WT组和PKD组（均 P<0.05）。肉眼可见CKO组小鼠肾脏体积较WT组增大了1倍左右，光镜下可观察到CKO组小鼠肾脏有多个大小形态不一的空泡，髓质组织间隙明显增加。CKO组小鼠肾脏系数、血清尿素氮和血清肌酐含量均显著高于WT组和PKD组（均 P<0.05）。 结论:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术可成功构建 Pkd1基因条件敲除小鼠，为进一步研究 Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用机制提供动物模型。

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象，利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO，通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异，初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法:在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA)，寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组，慢病毒包装系统转染293T细胞，收集纯化病毒感染K562细胞，嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆，有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO，Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株，同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL)，采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果:成功构建了用于TCRP1敲除的sgRNA-Cas9重组质粒载体，转染293T细胞后，利用有限稀释法成功筛选到TCRP1敲除的单克隆细胞株。与K562/cas9-CTL细胞相比，K562/TCRP1-KO细胞的增殖能力显著减弱，IM药物敏感性显著增强，细胞凋亡进程显著加快(均 P<0.05)。 结论:利用CRISPR/Cas9成功构建了TCRP1敲除的CML细胞株，TCRP1可能作为癌症相关基因影响CML细胞的增殖、IM耐药能力及凋亡进程。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种利用RNA指导核酸内切酶进行基因编辑的技术，具有操作简便、靶向精准、周期短、基因敲除效率高等特点，被广泛用于多个物种的基因编辑及疾病基因治疗中。目前，采用该技术已构建了多种眼科疾病动物模型，如角膜营养不良模型( UBIAD1、 TGF- β R124C基因突变)、青光眼模型( MYOC Y435H、 OPTN E50K和 PMEL基因突变)、白内障模型( GJA8、 KPNA4、 c- Maf、 AQP5和 PIKFYVE基因突变)、Leber先天性黑矇动物模型( KCNJ13和 LCA5基因突变)、视网膜母细胞瘤动物模型( RB1/ RBL基因突变)和视网膜色素变性动物模型( HKDC1、 C8ORF37、 CERKL、 PRCD、 ASRGL1、 LRAT和 PDE6B基因突变)等。还有研究者采用该基因编辑技术进一步证实了 MFRP、 CPAMD8、 Pax6和 FREM基因在动物眼部发育过程中的作用。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进行综述。

先天性肺疾病病因复杂，大多由单基因突变引起，目前临床治疗方法有限，病死率高。基因编辑技术的发展及广泛应用为呼吸系统单基因病的治疗带来新的希望，尤其是CRISPR/Cas9技术发挥着重要的作用。本文从常见呼吸系统单基因病入手，重点介绍CRISPR/Cas9作为基因编辑工具的特点及优势，以及基因编辑技术在原发性纤毛运动障碍、表面活性蛋白缺乏症、囊性纤维化和α 1-抗胰蛋白酶缺乏症中的应用进展，并浅析先天性肺疾病基因编辑技术应用所面临的机遇及挑战。