作为新一代的基因编辑技术，规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins，CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能，已被应用于许多领域。目前，已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein, Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测，具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制，以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。

目的:探讨孕晚期孕妇生殖道定植及侵袭性感染患儿的B族链球菌（group B Streptococcus，GBS）规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）分布及其与多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、耐药基因的关系。 方法:回顾性收集2017年1月至2022年1月山西医科大学附属儿童医院（山西省妇幼保健院）收治的孕晚期孕妇定植GBS及GBS侵袭性感染患儿临床分离的84株GBS菌株（包括侵袭性菌株17株、定植菌株67株），检测其CRISPR、MLST、耐药表型及耐药基因。采用 χ 2检验或Fisher精确概率法进行统计分析，并采用MEGA11构建发育树图。 结果:84株中共有10种ST型别，最常见的是ST10（46.4%）。GBS对青霉素敏感，对红霉素和克林霉素的耐药率分别为75.0%和73.8%；17株GBS侵袭性菌株中，ST10型对红霉素、克林霉素以及左氧氟沙星耐药率达100%。62株检出 CRISPR1基因，阳性率为73.8%； CRISPR1阳性菌株中ST10占比显著高于 CRISPR1阴性菌株［56.5%（35/62）与18.2%（4/22）， χ 2=9.56， P=0.002］； CRISPR1阳性菌株中检出 ermB、 gyrA、 parC比例明显高于阴性菌株［分别为54.8%（34/62）与22.7%（5/22）、67.7%（42/62）与36.4%（8/22）及71.0%（44/62）与36.4%（8/22）， χ 2值分别为6.73、6.64及8.25， P值均<0.05］，而 ermA的比例低于阴性菌株［6.5%（4/62）与31.8%（7/22）， χ 2=7.09， P=0.008］。 结论:ST10是孕妇生殖道定植GBS及婴儿侵袭性GBS感染的主要基因型；GBS对青霉素敏感；在 CRISPR1阳性菌株中ST10型GBS占优势； CRISPR1与部分耐药基因的传播相关。

目前核酸检测技术已被广泛应用于临床实验室诊断，常规检测技术如实时荧光定量PCR技术耗时长且依赖特定的仪器设备。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统是细菌和古细菌在与病毒斗争过程中获得的适应性免疫防御机制，已被发展成强大的基因组编辑技术。最近CRISPR领域的先驱团队基于Cas13a、Cas12a和新发现的Cas14蛋白开发出SHERLOCK、DETECTR等新型核酸检测工具，在传染性疾病的快速诊断、癌症中基因突变的检测和基因分型等方面意义重大，其灵敏度高、特异性强且快速经济，在临床分子诊断领域具有巨大潜力。本文综述了CRISPR/Cas系统的作用机制及新型诊断平台的原理和应用进展，总结了新型检测技术的优缺点并对其发展前景进行展望。

目的·筛选高级别胶质瘤(high-grade gliomas,HGGs)共有的表观转录靶向治疗新策略,并进行体外治疗效果的测试与相关分子机制的探究.方法·对HGGs中恶性程度和致死率均较高的多个胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)和弥漫性内生性脑桥胶质瘤(diffuse intrinsic pontine glioma,DIPG)细胞系进行表观转录相关的靶向小分子药物库筛选和基于CRISPR-Cas9系统的功能基因组筛选,以寻找在GBM和DIPG中共同的表观转录靶向治疗新策略.然后针对筛选得到的目标表观转录调控因子,分别测试经CRISPR-Cas9方法敲除该基因以及对应的靶向小分子处理对GBM和DIPG细胞系的体外生长、细胞增殖与凋亡的影响.继而对靶向小分子处理的GBM和DIPG细胞系进行RNA-seq转录组分析,解析其抗肿瘤分子机制.基于此分析结果,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)、蛋白质印迹法以及流式细胞术进一步验证目标表观转录调控因子的抗肿瘤分子机制.结果·针对表观转录调控因子的靶向小分子药物库筛选和功能基因组筛选鉴定出CDK12和CDK13(CDK12/13)是GBM和DIPG共同的潜在治疗新靶点.在多个GBM和DIPG细胞系中,通过CRISPR-Cas9方法敲除CDK12能够显著降低其体外细胞活性.CDK12/13抑制剂SR-4835或THZ531也均能够通过拮抗细胞增殖和促进细胞凋亡造成这2类HGGs细胞系的体外生长受到显著抑制.SR-4835处理GBM和DIPG细胞之后的RNA-seq转录组分析结果表明,HGGs细胞中受CDK12/13抑制剂作用而表达显著下调的基因主要富集在转录调控、DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)通路、泛素-蛋白酶体通路以及细胞周期等生物学过程.进一步通过一系列实验方法验证了在DIPG和GBM中,靶向抑制CDK12/13显著下调DDR相关基因的转录进而引起DNA损伤的累积,并诱导细胞发生G2-M细胞周期阻滞.结论·CDK12/13是GBM和DIPG这2类HGGs共同的潜在表观转录靶向治疗靶标;该发现为后续体内模型验证、组合治疗测试提供了理论支持,也为未来进一步的临床转化应用奠定了基础.

目的:探讨细胞周期蛋白依赖性激酶7 (cyclin-dependent kinase 7,CDK7)对卵巢癌细胞增殖的作用.方法:应用特异性siRNA转染法沉默卵巢癌OVCA433、TOV-112D和IGROV1细胞中CDK7基因表达后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力.应用成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及其相关核酸内切酶9(CRISPR-associated endonuclease 9,Cas9)基因编辑系统敲除卵巢癌HEY、OVCA420、OVCA433和IGROV1细胞中的CDK7基因后,采用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力.用CDK7抑制剂THZ1处理卵巢癌TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8、OV90、SKOV3和COV413B细胞后,采用CCK-8法和克隆形成实验检测TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8和OV90细胞增殖和克隆形成能力,蛋白质印迹法检测IGROV1、OVCA433、SKOV3和COV413B细胞中CDK7蛋白表达水平和RNA聚合酶Ⅱ磷酸化水平.结果:沉默或敲除CDK7基因后,卵巢癌细胞的增殖和克隆形成能力均明显减弱(P值均＜ 0.05).THZ1处理可抑制卵巢癌细胞的增殖和克隆形成,并下调CDK7蛋白表达和RNA聚合酶Ⅱ磷酸化(P值均＜0.05).结论:CDK7可能通过调控RNA聚合酶Ⅱ磷酸化,促进卵巢癌细胞的增殖.

随着人类等物种的基因组计划的完成,关于基因组的研究已经从结构基因组学转向了功能基因组学.将基因组的序列信息转化为功能信息,解密生命的密码,完成基因组的功能注释对于全面理解生长发育、疾病衰老、学习记忆等过程具有重大意义.黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)具有易于饲养、生命周期短、繁殖能力强、染色体简单等诸多优点,因此成为科研领域最为经典、最为重要的模式生物之一.更为重要的是,果蝇基因高度保守且与人类基因同源性高,80%以上果蝇基因与人类基因同源, 60%以上人类致病基因都存在果蝇中.利用果蝇的遗传技术,可以方便地研究基因功能.据文献报道,许多重要基因编码的蛋白质(如 polycomb、HP1等)和重要的细胞信号通路(如 Hh、Toll 等)就是首先在果蝇中发现,随后在其他模式动物和人类中被发现而且发挥同样功能.因此,果蝇上的研究成果可供对人类疾病的相关研究借鉴参考,同时还摆脱了伦理方面的限制.

病毒性传染病是威胁人类健康的重要因素,迫切需要新的治疗方法来降低由急性病毒感染如鼻病毒和登革热病毒以及慢性病毒感染如人类免疫缺陷病毒1和乙型肝炎病毒引起的发病率和死亡率.随着分子生物学技术的发展,靶向序列特异性的基因编辑技术成为传染病治疗的有力工具.其中规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9,Cas9)凭借其高效、简便、高特异性等特点被广泛应用于细胞系和动物模型中的传染病治疗,从而成为有前景的新型传染病治疗模式.目前,利用病毒和非病毒载体将Cas9以DNA、mRNA或蛋白质的形式递送到细胞中的可行性研究和评估CRISPR-Cas9体内适用性的临床试验已经在进行中.本篇综述中,我们将对CRISPR-Cas9的原理,其应用于传染病治疗的最新研究进展以及该技术面临的挑战和可预测性的解决方法等加以概述,并进一步展望其未来的发展方向.

生物技术药物是21世纪医药工业发展的中坚力量,其中单克隆抗体类药物是生物技术药物的典型代表,是恶性肿瘤、自身免疫病等领域全球销售额最高的药品种类.在抗体药物发展的几十年里,随着基因工程、蛋白质工程等领域的发展,抗体生产的宿主细胞建立、表达、纯化等各阶段的技术均不断取得突破,文中综述和讨论了抗体药物生产所采用的真核哺乳动物细胞表达系统、原核大肠杆菌表达系统、转基因动物反应器、无细胞蛋白质合成系统以及相关的关键技术进展.

目的 探讨微丝微管交联因子1(MACF1)在胃癌侵袭转移中的作用.方法 收集2009年至2012年于郑州大学第一附属医院行胃癌根治术的107例患者的胃癌组织及其所对应的癌旁正常组织的蜡块,采用免疫组织化学法检测组织中的MACF1蛋白质表达情况.另收集2017年于郑州大学第一附属医院行胃癌根治术的42例患者的胃癌组织和癌旁正常组织的新鲜标本,采用实时荧光定量PCR检测组织中的MACF1 mRNA表达情况.建立MACF1敲除的胃癌细胞株,采用细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验验证MACF1对细胞侵袭转移能力的影响,应用纤丝状肌动蛋白(F-actin)染色分析MACF1对肌动蛋白的影响.统计学方法采用t检验、卡方检验和多因素分析.结果 MACF1蛋白质在胃癌组织中的高表达率为71.0％ (76/107),高于其所对应的癌旁正常组织中的22.4％(24/107),差异有统计学意义(t=4.145,P=0.016);42例胃癌患者癌组织中MACF1 mRNA的表达水平为6.463±0.672,高于其所对应的癌旁正常组织中的1.727±0.331,差异有统计学意义(t=6.326,P＜0.01).MACF1蛋白质高表达率在不同肿瘤浸润深度、不同TNM分期和有无淋巴结转移中差异均有统计学意义(x2=1.170、7.959、5.288,P均＜0.01).MACF1蛋白质高表达胃癌患者的5年生存率为32.9％(25/76),低于正常表达胃癌患者的64.5％ (20/31),差异有统计学意义(x2=25.093,P=0.034).MACF1蛋白质高表达是影响胃癌患者术后总体生存率的独立预后因素[风险比(HR)=0.513,95％ CI0.411 ～ 0.922,P=0.038].细胞划痕实验显示,划痕24 h后,MACF1敲除AGS细胞迁移能力为(18.77±3.82)％,低于野生型AGS细胞的(76.24±5.36)％,差异有统计学意义(t=6.249,P=0.014);MACF1敲除HGC27细胞迁移能力为(42.48±7.37)％,低于野生型HGC27细胞的(82.35±4.28)％,差异有统计学意义(t=5.938,P=0.017).Transwell小室迁移实验显示,MACF1敲除AGS细胞迁移细胞数为87.0±11.0,少于野生型AGS细胞的200.0±16.0,差异有统计学意义(t=5.820,P=0.028);MACF1敲除HGC27细胞迁移细胞数为151.0±13.0,少于野生型HGC27细胞的268.5±20.5,差异有统计学意义(t=4.840,P=0.040).F-actin染色结果显示,MACF1敲除AGS细胞中的肌动蛋白微丝束数量为216.60±18.09,少于野生型AGS细胞的491.30±5.02,差异有统计学意义(t=14.630,P =0.005).结论 MACF1在胃癌组织中异常高表达,与胃癌患者的不良预后可能相关,并通过影响F-actin和细胞骨架的形成促进胃癌细胞的侵袭和转移.

目的:探讨AUF1在胞质DNA引起的细胞葡萄糖代谢应答中的作用及其机制.方法:(1)用核质分离技术分离细胞核与细胞质,并通过生物素-亲和素亲和层析技术分离细胞质中与胞质DNA (ISD)结合的蛋白质,然后通过“银染-质谱”和“复合物-质谱”技术鉴定出差异蛋白——AUF1.再利用体外结合实验验证AUF1与胞质DNA的相互作用.(2)在胞质DNA刺激后,通过ATP检测试剂盒和CCK8细胞氧还活力检测试剂,比较野生型细胞和基于CRISPR/Cas9技术的AUF1基因敲除细胞中葡萄糖代谢应答情况.(3)通过半定量PCR技术,在野生型、基因敲除AUF1、基因敲除后回补AUF1或空载体的四类细胞中检测葡萄糖转运蛋白GLUTs以及葡萄糖代谢相关酶的mRNA表达情况,筛选出与细胞糖代谢相关的AUF1下游效应分子——GLUT3.进而用实时荧光定量PCR进行验证.(4)通过半定量和荧光定量PCR分析胞质DNA刺激下GLUT3的mRNA变化情况,分析胞质DNA的刺激是否影响GLUT3的mRNA表达.结果:(1)两次质谱分析均发现AUF1能与ISD结合.体外结合实验也证实,不论是原核表达的GST-AUF1还是真核细胞表达的GFP-AUF1均能与单链和双链的ISD相结合.(2)基因敲除AUF1后的HEK293细胞在用胞质DNA刺激后,胞内的ATP水平和对CCK8的还原能力都明显高于野生型细胞.提示AUF1基因敲除细胞内的葡萄糖代谢不受胞质DNA刺激所抑制,说明AUF1很可能参与了胞质DNA对细胞糖代谢的调节.(3)半定量PCR技术检测发现在AUFI敲除的细胞中GLUT3的mRNA明显减少,而其他的GLUT家族成员和代谢酶则没有显著差异.实时荧光定量PCR证实上述现象,提示AUF1很可能通过稳定GLUT3的mRNA参与葡萄糖代谢的调节.(4)无论是单链还是双链ISD刺激后的细胞中,GLUT3的mRNA均减少,说明GLUT3可能是胞质DNA对糖代谢的调节过程中的一个下游效应分子.结论:AUF1能与胞质DNA结合,很可能通过调节下游GLUT3的mRNA稳定性参与胞质DNA引起的糖代谢应答反应.