采用富集培养和多环芳烃双加氧酶基因检测方法,从焦化场地多环芳烃污染土壤分离筛选出9株PAHs降解菌.以高分子量多环芳烃芘为唯一碳源进行摇瓶降解实验,结果表明,J6、S5、S4、S2和B4对芘具有较好的降解能力,21 d时芘降解率均达55％以上,其中B4处理芘的降解率最高,达到70.2％.进一步研究了该5株菌及其混合菌对土壤中芘的降解效果,发现混合菌的降解效果高于单菌的降解效果,其中混合菌H4和单菌B4的降解效果较好,49 d时混合菌H4和单菌B4处理土壤中芘的降解率达29.3％和18.3％.经过16S rRNA基因序列比对,鉴定J6菌株为赤红球菌(Rhodococcus ruber),S5为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),S4和S2是鞘脂单胞菌属(Sphingopyxis sp.),B4为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).在电场条件下,混合菌H4和单菌B4处理微生物数量及活性均显著提高,芘的降解率较单独H4和B4处理提高33.0％和20.1％,说明筛选出的5株高分子量多环芳烃降解菌具有较强的电场适应能力,可在高分子量多环芳烃污染土壤电动-微生物修复中应用.

本研究通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶(DGC)基因,并对该酶进行生物信息学分析,研究其在甲苯和苯酚胁迫下的转录水平变化,为进一步研究该酶和赤红球菌SD3有机溶剂耐受性之间的关系奠定基础.综合使用煮沸法和冻融法提取赤红球菌SD3的总DNA,利用PCR扩增和T载体克隆获得DGC基因序列;利用生物信息学手段对DGC的理化性质和结构特征进行分析;利用邻位相连法构建进化树;采用Discovery studi0 3.5将DGC与底物GTP进行分子对接;采用qPCR方法分析DGC基因在甲苯和苯酚胁迫下的转录变化情况.克隆获得了赤红球菌SD3的DGC基因序列,在GenBank中的序列登录号为MH482549.该基因的开放阅读框长为1 332 bp,编码443个氨基酸,预测蛋白分子量为46.95kD,是疏水性蛋白.无信号肽和二硫键,含有6段跨膜区,第181～316位氨基酸之间存在一个GGDEF保守结构域和c-di-GMP结合抑制位点(Ⅰ位点).亚细胞定位分析表明,DGC属于质膜蛋白.DGC中超过50％的氨基酸参与形成α螺旋结构.进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus aetherivorans的DGC聚为一簇,推测赤红球菌SD3的DGC也属于ClassⅢnucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能.分子对接表明DGC和GTP分子通过疏水作用和氢键产生相互作用.qPCR结果表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中DGC基因的转录分别上调了1.57倍和8.71倍.研究表明,赤红球菌SD3中的DGC催化GTP产生c-di-GMP,并且DGC基因的转录在有机溶剂胁迫下发生显著上调,这暗示c-di-GMP与赤红球菌SD3的有机溶剂耐受性可能相关.

红球菌属微生物因其自身较强的有机物耐受性和较宽的降解谱,能够适应多种生境而被广泛应用于生物脱硫、石油污染修复、有毒有机化合物降解、污水处理等领域.本研究利用单分子PacBio测序技术,对一株耐有机溶剂的赤红球菌SD3 (Rhodococcus ruber SD3)全基因组进行测序并进行生物信息学分析.该菌株的全基因组长度大约为5.37 Mb,GC含量为70.63％,GenBank序列登录号为CP029146.使用Barmap0.4.2和tRNAscan-SEv l.3.1软件对基因组中包含的rRNA基因和tRNA基因进行预测,发现有12个rRNA基因和53个tRNA基因.利用Glimmer3.02软件对该基因组进行基因预测,共得到5 120个编码蛋白的基因.将预测的蛋白序列同时与KEGG、STRING和GO三类数据库进行Blastp比对,共计2 836个蛋白基因获得COG功能注释,并且注释得到3 130条GO功能条目和2 190条KEGG通路条目.此外,基于荧光定量PCR的分析表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中热休克蛋白DnaK的表达分别上调了29.87倍和3.93倍.这些研究结果为赤红球菌的遗传改造和揭示赤红球菌的有机溶剂耐受性机制提供了理论依据.

位点-2蛋白酶(S2P)作为一种在大多数细菌中存在的金属蛋白酶,在受控膜内蛋白水解(RIP)中发挥重要作用.赤红球菌中关于S2P类似蛋白作用何种底物未见报道.本研究利用分子对接的方法在赤红球菌SD3中筛选S2P类似蛋白的底物,克隆底物蛋白基因,并进行生物学信息分析.通过筛选发现S2P类似蛋白的底物为一个组氨酸激酶.该基因在GenBank中的序列登录号为MN688330.它的开放阅读框长为1 410bp,编码469个氨基酸,其蛋白分子量为49.62kD,信号肽存在几率为0.6765,信号肽锚定几率为0.2113,信号肽的切割位点位于35～36位氨基酸之间.该蛋白属于不稳定疏水性蛋白,同时有3个明显的疏水峰,没有二硫键,含有1段跨膜区,二级结构主要以α螺旋为主,亚细胞定位表明组氨酸激酶在细胞膜上发挥生物学作用.组氨酸激酶的第164～455位氨基酸之间包含多种保守结构域,属于多种超家族.进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus pyridinivorans SB3094的组氨酸激酶聚为一簇.荧光定量PCR分析表明在甲苯和苯酚的胁迫下,组氨酸激酶的表达分别下调到对照样品的0.76倍和0.78倍.本研究为进一步揭示赤红球菌SD3中蛋白酶解所涉及的信号转导途径奠定基础.

通过响应面法对硝化菌——赤红球菌(Rhodococcus ruber)HDRR2Y的发酵培养参数进行优化,以提高其活菌数.首先通过单因素实验筛选出赤红球菌HDRR2Y的最优碳、氮源,并采用Plackett-Burman实验得到影响活菌数的显著因素,然后进行响应面实验,经最陡爬坡及回归分析得出最佳培养参数,最后以摇瓶实验检验其合理性.结果显示,赤红球菌HDRR2Y的最优碳、氮源分别为乙酸钠和酵母膏+蛋白胨+氯化铵(1∶1∶1,质量比),显著影响活菌数的因素有碳、氮源及温度,经回归分析得到的最优培养参数为乙酸钠5.48 g/L、酵母膏+蛋白胨+氯化铵4.96 g/L、温度29.24℃、pH 7.0、转速200 r/min、MgSO4 0.2 g/L、KH2P040.5 g/L、NaC19 g/L、CaCl2 0.5 g/L、MnSO4 0.025 g/L、FeSO4 0.05 g/L、C5H9NO4 0.002 g/L、接种活菌数 1×104 cfu/mL、装液量40％(体积分数)、培养时间36 h.优化后的实际活菌数为1.54×109 cfu/mL,远高于优化前的活菌数(1.8×108 cfu/mL)(P＜0.01).因此,采用响应面法优化赤红球菌HDRR2Y的发酵培养参数能大幅提高其发酵活菌数,为硝化菌剂的工业化生产提供数据参考.