目的 基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)诱导表达系统制备呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial vi-rus,RSV)口服疫苗,并对其免疫原性进行分析.方法 将构建的质粒pUC57-Pre F与pNZ8149分别经Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,酶切产物经T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒pNZ8149-Pre F,电转化至感受态L.lactis NZ3900,经乳糖培养基筛选获得非分泌型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F,以nisin A为诱导剂诱导表达,经Western blot和免疫荧光标记对其表达产物进行分析;将雌性BALB/c小鼠随机分为PBS、L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组,15只/组,每只口服500 μL,于第1、2天进行初次免疫,第16、17天进行加强免疫,第14和28天经小鼠下颌取血并分离脾脏细胞,ELSIA法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的体液和黏膜免疫应答水平,ELISpot法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的细胞免疫应答水平.结果 重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F经PCR及测序鉴定,证明构建正确;抗原蛋白Pre F特异性地表达在L.lactis NZ3900中,相对分子质量约 50 000;初次免疫后第 14 和 28天,与 PBS 和L.lactis NZ3900/pNZ8149组相比,L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组小鼠血清Pre F-特异性IgG抗体效价、肠洗液中特异性分泌型IgA抗体以及脾脏细胞中IFNγ和IL-4分泌水平均明显升高,且差异均有统计学意义(t=-30.268～-3.087,P均＜0.05).结论 基于L.lactis诱导表达系统构建的RSV 口服疫苗具有较强的免疫原性,为研发RSV黏膜疫苗提供了参考,也为开发其他病毒或细菌口服疫苗提供了新的研究策略及方法.

目的 构建一种耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)多黏菌素B的快速药敏试验方法,为临床抗生素的选择和精准调整提供依据.方法 采用WHONET 5.6软件对分离自西安市第一医院2023年3月至2024年3月的108株CRE菌株信息进行筛选,以肉汤稀释法为参比方法,采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行多黏菌素B快速药敏测定.结果 108株CRE分离株以肺炎克雷伯菌为主(48.14％),其次是产气肠杆菌和奇异变形杆菌(各占13.89％).标本来源以痰液为主(65.74％),其次尿液(18.52％)和血液(8.33％).临床科室分布以神经外科为主(48.15％),其次为重症医学科(18.52％)和呼吸内科(14.81％).CRE分离株对大部分药物呈现高度耐药,对常见β内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、β内酰胺复合药物耐药率分别超过70％,80％,50％和75％.与肉汤稀释法相比,MALDI-TOF-MS法测定CRE对多黏菌素B药敏结果的分类一致率(CA)为98.1％,重大误差(ME)为1.85％,未出现非常重大误差(VME),均在可允许范围之内.结论 本院分离的CRE对多种抗菌药物广泛耐药,基于MALDI-TOF-MS的快速药敏试验方法准确可靠,可用来评价CRE对多黏菌素B的敏感性,便于临床及时调整泛耐药细菌治疗方案.

目的 利用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶(CV2025)基因序列构建重组质粒pET-28a-CV2025,并在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中进行原核表达.方法 将CV2025基因序列与pET-28a(+)载体连接,构建重组质粒pET-28a-CV2025,转化E.coliTOP10中进行阳性克隆子筛选,经双酶切及测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,诱导表达目的蛋白;将重组菌28a-CV2025-BL21活化后接种2TY液体培养基,IPTG诱导表达制备粗酶液后,以异丙胺为氨基供体,1-(4-甲氧苯基)乙酮、邻氟苯乙酮、苯乙酮为氨基受体,采用薄层色谱法监测反应,初步检验转氨酶活性,高效液相色谱法进行进一步分析.结果 重组质粒pET-28a-CV2025经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组菌28a-CV2025-BL21、28a-CV2025-Rosetta的表达产物均可见相对分子质量约51 000的目的蛋白条带,且28a-CV2025-BL21表达的蛋白大部分以可溶性形式存在;酶液催化后,1-(4-甲氧苯基)乙酮与异丙胺发生转氨基化反应,生成对应的手性胺1-(4-甲氧苯基)乙胺,具有一定的催化活性.结论 在E.coli中成功表达了CV2025,初步检验上清中可溶性蛋白具有酶活性,为后期转氨酶的分离、纯化以及增强产物转化率奠定了基础.

为探究外源五价砷(arsenate,As(Ⅴ))输入对砷污染环境沉积物原位微生物厌氧发酵和群落结构影响,阐释As(Ⅴ)与砷污染河口沉积物微生物群落结构互作效应,本研究以辽宁省葫芦岛市某锌厂排污口下游高砷污染的五里河河口沉积物为对象,通过外源添加As(Ⅴ)(1、10、60mg·L-1)进行富集培养,测定产氢产酸、pH与碳源消耗等理化参数,结合高通量测序技术检测沉积物中微生物群落组成变化;同时采用平板稀释涂布方法筛选高浓度As(Ⅴ)富集菌液中优势菌株.结果表明,富集培养过程中,所有处理组的砷形态都发生了转化,其中在60 mg·L-1外源As(Ⅴ)投加下,约43％的As(Ⅴ)转化为三价砷(tarsenite,As(Ⅲ));微生物群落组成自原始沉积物的11个门转为单一厚壁菌门(Firmicutes),优势菌属狭义梭菌属1(Clostridium_sensu_stricto_1)占据优势生态位.自60 mg·L-1的As(Ⅴ)输入的富集菌群中,筛选分离出一株厌氧发酵丁酸梭菌(Clostridium butyricum CXL-1),该菌株具有较高的As(Ⅲ)耐受性(≥200 mg·L-1),并能利用葡萄糖发酵代谢产生有机酸和H2等发酵产物,为硫酸盐还原菌、产甲烷古菌等提供氢气和碳源.本研究结果可为砷污染环境微生物厌氧矿化修复提供参考.

目的:观察大鼠多系分化持续应激(Muse)细胞对肠上皮细胞间紧密连接结构的保护作用。方法:贴壁筛选法自大鼠(6只，购自中国食品药品检定院)股骨内分离大骨髓间充质干细胞(BMMSCs)，长时间胰蛋白酶孵育法(LTi)自BMMSCs中分离大鼠Muse细胞，流式细胞术标记如白细胞分化抗原(CD)29、CD34、CD90等及特异阶段胚胎抗原-3(SSEA-3)抗体；免疫组织化学法标记Nanog同框蛋白(NANOG)等抗体，定向诱导分化后标记α-甲胎蛋白(AFP)等鉴定其多能分化能力；重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)建立体外肠上皮细胞损伤损伤模型；与Muse细胞共培养后检测细胞增殖能力及桥接蛋白-1(ZO-1)的表达水平及形态，组间比较采用 t检验。 结果:LTi后，大鼠BMMSCs中(2.57±0.57)%能够形成特征性的Muse细胞簇；流式细胞术结果表明，Muse细胞保留了BMMSCs表面分子特征，SSEA-3的阳性细胞比例[(73.2±1.4)%]显著高于BMMSCs[(2.3±0.3)%]；免疫荧光实验表明，培养的Muse细胞阳性表达NANOG等多能分化标记，定向诱导分化后分别能够表达AFP等分化标记；Muse细胞与TNF-α炎症损伤的肠上皮细胞共培养后，其增殖细胞比例[(40.06±1.04)%]高于损伤[(23.10±2.05)%]组的细胞( t＝12.79， P<0.05)及ZO-1蛋白的相对表达水平(0.55±0.03、0.27±0.01， t＝13.03， P<0.05)。 结论:大鼠Muse细胞具有更加理想的保护炎症损伤肠上皮细胞紧密连接结构的作用。

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:应用全外显子组测序鉴定一晶状体异位家系的致病基因。方法:对中国1个晶状体异位家系进行病史采集、体格检查，绘制家系图。收集家系3名患者和10名健康成员外周血各5 mL，提取基因组DNA。应用全外显子组测序方法，对测序结果进行分析，基因筛查和突变筛查排除后，对符合条件的突变进行Sanger测序验证和家系共分离分析。结果:该家系3名患者均有晶状体异位，超声心动图检查和骨骼检查未见明显异常。先证者经全外显子组测序，筛选突变基因，发现 FBN1基因和 ADAMTS17基因存在可疑致病突变，查阅文献排除 ADAMTS17基因突变致病的可能性。经Sanger测序验证及家系共分离分析，发现 FBN1基因第12外显子的错义突变(c.1421G>A，p.Cys474Tyr)符合条件。 结论:该家系符合单纯性晶状体异位疾病特征，通过全外显子组测序分析，发现 FBN1基因第12外显子上的杂合突变(c.1421G>A，p.Cys474Tyr)是导致该家系晶状体异位的主要致病原因。该突变为新的致病突变。

探讨医院未处理污水中碳青霉烯类耐药菌的流行情况、基因组特征及临床相关性，为院内评估公共卫生情况、预防交叉感染提供参考依据。收集2023年3月苏州大学附属第二医院污水处理站内未处理污水和26个病区洗手池U型排污管内污水，离心稀释后涂布于含有美罗培南（2 μg/ml）的LB固体平板分离耐药细菌，进行菌种鉴定、药敏分析、碳青霉烯酶基因PCR检测和全基因组测序；对基因组序列进行耐药基因识别，并采用回顾性研究方法，结合多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析，比较其与同季度临床分离株的同源性。结果显示，从医院污水中分离出56株耐碳青霉烯类革兰阴性菌，来源于13个属，其中17株分离自医院总污水，气单胞菌属为最优势属（35.3%，6/17）；39株分离自17个病区的污水，假单胞菌属为最优势属（30.8%，12/39）。本院常见污水分离株均为多重耐药细菌，对部分二、三代头孢菌素类药物耐药率可达100%。来源于污水分离株的碳青霉烯酶基因共8种，包括 blaKPC、 blaNDM、 blaIMP、 blaVIM、 blaIND、 blaOXA-58-like、 blaOXA-48-like和 blaOXA-427-like。共39株污水分离株携带碳青霉烯酶基因，医院总污水中携带 blaKPC-2细菌的分离率（35.3%，6/17）最高，病区污水中携带 blaIMP-8细菌的分离率（31.8%，7/22）最高。14株污水分离株同时携带两种碳青霉烯酶基因，共6种组合型。本院还发现了 blaIMP-101新亚型。筛选4株污水分离株和11株临床分离株纳入SNP分析，其中临床和污水来源的2株ST11型肺炎克雷伯菌仅有15个SNP差异，具有高度同源性。综上，医院未处理污水中存在多种多重耐药的条件致病菌，具有在环境中散播耐药基因的潜在风险；医院污水和临床分离的高度同源肺炎克雷伯菌表明医院污水与临床感染的紧密联系。医院需加强对污水环境中耐药细菌和耐药基因的监测，防止医院污水中耐药细菌和耐药基因的广泛传播，预防污水中耐药细菌引起的院内感染。

目的:探讨双唾液酸乳糖-N-四糖(DSLNT)对坏死性小肠结肠炎(NEC)新生大鼠肠道内容物低分子量代谢谱的影响，探索其对新生儿肠道的保护作用方式。方法:新生SD大鼠按随机数表法随机分为对照组、NEC组和NEC+DSLNT组，大鼠均采用特殊配方奶人工喂养，NEC组和NEC+DSLNT组以3次/d的频率进行缺氧(950 mL/L氮气，10 min)/冷刺激(4 ℃，10 min)、连续3 d诱导新生大鼠NEC模型，NEC+DSLNT组在特殊配方奶中添加300 μmol/L DSLNT。造模72 h时处死所有存活大鼠，采集回结肠部位肠内容物进行基于超高效液相色谱-组合型四级杆Orbitrap质谱仪(UHPLC-QE-MS)的非靶向代谢组检测，末端回肠行苏木精-伊红染色。代谢组数据用SIMCA 14.1软件进行多元变量统计分析。以正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)模型的变量投影重要度(VIP)值>1和 t检验中 P<0.05筛选两两比较的组间差异代谢物。 结果:DSLNT降低NEC发生率和NEC大鼠回肠组织病理学评分[3.0(2.0，3.0)分比1.0(1.0，2.0)分， P<0.01]，并可有效抑制炎症浸润。基于UHPLC-QE-MS代谢组检测结果建立的OPLS-DA模型能较好地对NEC组和对照组、NEC+DSLNT组和NEC组实现分离。NEC组和对照组之间有64个差异代谢物(OPLS-DA模型的VIP值>1且 P<0.05)，包括二十二碳六烯酸(+288.0%， P＝0.028)、黄嘌呤(+372.1%， P＝0.007)、L-精氨酸(+233.1%， P＝0.027)、L-亮氨酸(+232.7%， P＝0.015)、N-乙酰神经氨酸(-41.6%， P＝0.014)等，这些代谢物可映射到34条不同的代谢通路，其中精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等6条代谢通路为NEC主要扰动的代谢通路。NEC+DSLNT组与NEC组之间存在15种差异代谢物，包括D-甘露糖(-73.5%， P＝0.032)、黄嘌呤(-63.4%， P＝0.008)、亚油酸(+137.9%， P＝0.047)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(+278.2%， P＝0.005)等，这些差异代谢物可映射到7条代谢通路，其中亚油酸代谢为DSLNT主要影响的差异代谢通路。两种比对策略中重合的差异代谢物数量为8个，其在NEC中的变化趋势在DSLNT给药组中均出现显著逆转。 结论:DSLNT能显著缓解缺氧/冷刺激造成的新生大鼠NEC病理损伤，该保护作用与其改善NEC造成的肠内容物代谢谱偏移、调节亚油酸代谢通路有关。DSLNT的早期预防性补充对维护新生儿肠道稳态、预防NEC病理进程具有重要意义。

目的:以拥有不同抗菌药物耐药性的幽门螺杆菌( H. pylori)临床菌株为研究对象，基于全基因组测序探索 H. pylori对克拉霉素和左氧氟沙星(LVX)耐药相关新基因。 方法:纳入2016年9月1日至2019年8月31日在香港大学深圳医院消化及肝脏科因上消化道相关症状就诊且 13C尿素呼气试验阳性的1 749例患者，在行胃黏膜活体组织检查后进行胃黏膜组织 H. pylori分离培养，成功保存 H. pylori菌株90株。依据体外药敏试验结果，分别筛选克拉霉素单耐药(克拉霉素组)10株，LVX单耐药(LVX组)10株，克拉霉素和LVX双重耐药(双重耐药组)10株，克拉霉素、LVX、阿莫西林、呋喃唑酮、四环素、甲硝唑全敏感(全敏感组)10株，总计40株 H. pylori菌株。通过全基因组测序，与综合抗性基因数据库(CARD)进行比对，分析单核苷酸变异(SNV)和插入缺失突变情况，筛选 H. pylori对克拉霉素和LVX耐药相关基因并分析耐药相关新基因在4组间的表达差异。统计学方法采用独立样本 t检验、单因素方差分析、最小显著差数法和卡方检验。 结果:克拉霉素组、LVX组、双重耐药组、全敏感组SNV位点数[(74 952.00±8 755.21)、(77 128.10±3 191.35)、(78 639.90±601.23)、(77 474.60±2 421.05)个]和插入缺失突变数[(2 582.20±265.45)、(2 653.60±108.37)、(2 667.10±43.82)、(2 641.10±80.25)个]比较差异均无统计学意义(均 P>0.05)。与CARD进行比对，共检出223个耐药相关基因，其中克拉霉素组克拉霉素单耐药相关基因19个，LVX组LVX单耐药相关基因24个，双重耐药组中有克拉霉素单耐药相关基因16个，LVX单耐药相关基因14个，双重耐药相关基因12个；全敏感组中有克拉霉素单耐药相关基因11个，LVX单耐药相关基因17个，双重耐药相关基因13个。克拉霉素单耐药相关基因中，红霉素酯酶基因( ere)B在克拉霉素组、LVX组、双重耐药组、全敏感组的检出率(0/10、0/10、3/10、0/10)比较差异有统计学意义( χ2＝5.79， P＝0.049)；红霉素核糖体甲基化酶基因( erm)家族在克拉霉素组和双重耐药组中的检出率高于LVX组和全敏感组[45.0%(9/20)比10.0%(2/20)]，差异有统计学意义( χ2＝6.14， P＝0.013)，游离甲硫氨酸-(R)-亚砜还原酶基因( msrC)在克拉霉素组、LVX组、双重耐药组、全敏感组检出率(10/10、7/10、6/10、4/10)比较差异有统计学意义( χ2＝8.97， P＝0.030)。LVX单耐药相关基因中，喹诺酮抗性五肽重复蛋白基因( qnr)家族在LVX组和双重耐药组的检出率高于克拉霉素组和全敏感组[60.0%(12/20)比25.0%(5/20)]，差异有统计学意义( χ2＝5.01， P＝0.025)； qnrB4在克拉霉素组、LVX组、双重耐药组、全敏感组检出率(1/10、3/10、7/10、1/10)比较差异有统计学意义( χ2＝10.17， P＝0.010)。4组中克拉霉素单耐药相关外排转运的基因个数少于LVX单耐药和双重耐药相关基因个数(11个比29个，11个比23个)，差异有统计学意义( χ2＝11.87、5.80， P＝0.001、0.016)。LVX相关外排转运基因在克拉霉素、LVX组、双重耐药组、全敏感组检出个数(28、40、24、27个)比较差异有统计学意义( χ2＝10.26， P＝0.016)。 结论:erm家族和 msrC可能是介导 H. pylori对克拉霉素耐药的重要基因， qnr家族与介导 H. pylori对LVX耐药相关。外排转运基因可能在药物外排过程中有协同作用，其更倾向介导 H. pylori对LVX耐药。