本研究应用土壤稀释涂布平板法对转基因银中杨(S13系列)根际土壤五大微生物数量进行了测定,并进一步分析了土层深度与土壤微生物数量间的关系.研究表明:0～30 cm 与30～60 cm 土样中,五大根际土壤微生物(细菌, 真菌, 放线菌, 芽孢杆菌, 固氮菌)分布比例一致,均为细菌占主体,其次为固氮菌、放线菌、芽孢杆菌,真菌最少;30～60 cm 土样中,转基因银中杨与对照组银中杨根际土壤中真菌数量有显著差异(p=0.032);转基因银中杨对其根际土壤微生物主要类群的数量影响不显著,芽孢杆菌除外(p=0.036).从整体上看,该试验林地内的转基因银中杨并未影响其根际土壤微生物的数量.

组蛋白去乙酰化酶在植物非生物胁迫应答反应中具有重要的调控作用.利用RT-PCR的方法从毛果杨中克隆了组蛋白去乙酰化酶基因HDA902.利用农杆菌介导法将其遗传转化到烟草中,并对转基因植株进行低温耐受性分析.研究结果表明,HDA902在烟草中的表达显著提高了转基因株系对低温的耐受性.叶片NBT和DAB染色结果表明,在低温处理后转基因烟草比野生型烟草产生较少的活性氧.丙二醛和脯氨酸含量测定结果表明,在低温条件下,转基因烟草叶片的脯氨酸含量显著高于野生型烟草,而丙二醛含量显著低于野生型烟草.这些研究结果表明,HDA902参与低温胁迫应答反应,其过量表达提高了植株耐低温的能力.

克隆小黑杨HD-ZIP家族基因PsnHB13,对该基因进行生物信息学分析、过表达载体构建、烟草的遗传转化.结果 表明小黑杨PsnHB13基因cDNA全长870 bp,编码289个氨基酸.成功构建植物过表达载体pROKⅡ-PsnHB13,并通过农杆菌介导的叶盘法将外源基因转入野生型烟草.检测结果显示PsnHB13已成功整合入烟草基因组中,并在mRNA水平表达.通过观察转基因烟草的生长,发现过表达PsnHB13基因的烟草与野生型相比出现叶面积变小、叶型变长,根系生长缓慢,花朵变小等明显表型.说明PsnHB13基因主要对烟草叶片、根系及花的生长发育起到负调控作用.本文为研究PsnHB13基因对杨树生长发育的影响提供理论基础.

D类细胞周期蛋白(D-type cyclin,CYCD)调控细胞周期G1/S期转变.CYCD与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)结合形成CYCD/CDK复合物,被激活的CYCD/CDK复合物通过磷酸化下游细胞周期响应因子调控细胞周期有序进行,进而影响植物的生长发育.该研究以‘741杨’为实验材料,成功鉴定得到1个D2类细胞周期蛋白基因(PtoCYCD2;1).研究表明:(1)实时定量PCR(qRT-PCR)显示,PtoCYCD2;1基因在根、茎、叶、叶柄、树皮和木质部中均有表达,在叶中的相对表达水平最高.(2)亚细胞定位表明PtoCYCD2;1蛋白定位于细胞核.(3)与野生型(Wild-Type poplar,WT)相比,过表达PtoCYCD2;1基因的‘741杨’出现株高降低,茎直径减小,叶片明显下卷的表型.(4)扫描电镜分析(SEM)显示,转基因杨树叶片的上表皮细胞平均面积变小,细胞数量增多;树脂切片结果显示与WT相比,转基因杨树叶片的栅栏组织和海绵组织的细胞间隙疏松.(5)qRT-PCR结果显示,转基因杨树中细胞周期调控基因CDKA;1、CDKB1;1和CDKB2;1的表达水平显著上调,植物成视网膜细胞瘤相关蛋白1 (retinoblastoma-related protein1,RBR1)基因、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(kip-related protein,KRP)基因的表达水平显著下调.该研究结果为进一步研究木本植物CYCD2基因的功能奠定了基础.

为研究水通道蛋白PtPIP2;8基因功能,了解其不同表达水平的转基因84K杨(Populus alba ×P.glandulossa)应对干旱胁迫的响应,该文以转PtPIP2;8 84K杨抑制表达株系(抑制表达)、野生型(WT)和转PtPIP2;884K杨超表达株系(超表达)为试验材料,测定PtPIP2;8表达水平、根系导度、光响应曲线、气体交换参数、生长及根系形态指标.结果显示:(1)WT植株PtPIP2;8仅在根系表达;超表达植株PtPIP2;8除在根部显著表达外,在茎和叶片中也显著表达;抑制表达植株PtPIP2;8仅在根部有微量表达,表达量分别是WT和超表达植株的1/20和1/80.(2)根系结构分析发现,超表达植株总根长、总根表面积、总根体积、总根尖数显著低于WT和抑制表达植株,根系导水率显著高于WT和抑制表达植株,表明PtPIP2;8参与了植物根系水分运输,提高了水分运输效率.(3)正常水分条件下,抑制表达植株苗高、叶面积显著低于WT和超表达植株,根冠比显著高于WT和超表达植株.干旱胁迫后,抑制表达植株净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)下降幅度小,仍能维持较高的Pn.气体交换参数显示抑制表达植株Pn、Gs日变化为"单峰"型,属气孔因素引起的净光合速率下降;WT和超表达植株Pn、Gs日变化为"双峰"型,干旱胁迫后,抑制表达植株Pn略微下降,WT和超表达植株Pn均下降,尤其是13:00、15:00下降显著,表明WT和超表达植株对干旱胁迫更加敏感,干旱对其影响更大.(4)干旱胁迫后,抑制表达植株相对生长速率、总生物量降低的最少,根冠比最高;总根表面积、总根体积、总根尖数显著高于WT植株.表明PtPIP2;8直接参与水分运输并提高水分运输效率,其转化影响了植株根系发育和生长.超表达植株根系发育的下降和叶面积的增大减弱了它的抗旱性,而抑制表达植株矮小,降低的叶面积,增加的根系生长和根冠比提高了它的抗旱能力.从研究结果来看,水通道蛋白提高了水分跨膜运输效率,而非水通道蛋白导水机制对干旱有较强的耐受性.

ERF(ethylene response factor)转录因子是植物最大的特异性转录因子基因家族之一,在植物抗逆及生长发育方面起着重要作用.本研究从'84K杨'(Populus abla x P.glandulosa)中克隆出ERF转录因子基因RAP2L15的全长cDNA序列,对其编码的氨基酸序列进行了同源性比对分析,并利用生物信息学对RAP2L15蛋白进行理化性质分析及结构预测.结果表明,RAP2L15编码的蛋白质序列含有155个氨基酸,属于不稳定的亲水蛋白,与杨树耐盐胁迫基因ERF38具有相似结构.同源性序列比对分析表明RAP2L15与拟南芥ERF转录因子基因AtERF016具有较高同源性,推测该基因可能与植物耐盐胁迫功能有关.构建RAP2L15-RNAi抑制表达载体并利用农杆菌介导叶盘转化法进行杨树遗传转化,获得转基因杨树株系5个.本研究为进一步探索R4P2L15转录因子基因在杨树生长发育及抗盐胁迫方面发挥的功能提供理论及材料基础.

[目的]转Bt基因棉花和转Bt基因杨树在我国已推广使用.本研究的目的是调查和分析不同转基因杨棉复合系统内地上节肢动物群落多样性变化,为转基因杨树大规模应用提供生态安全方面的数据.[方法]2019年4-10月,在河北任丘采取欧洲黑杨Populus nigra林下种植转基因棉花Gossypium hirsutum的模式,设置转基因杨树-转基因棉花(复合生态系统1)和非转基因杨树-转基因棉花(复合生态系统2)两种杨棉复合系统,调查杨树和棉花地上部植株节肢动物种类和个体数量,比较节肢动物各功能群的物种数量和个体数量以及香农指数、优势集中性指数、均匀度指数等群落多样性指数,并测定了转基因杨树和棉花叶片Bt蛋白含量.[结果]复合生态系统1中转基因杨树和棉花各自植株上鳞翅目种群累计个体数均显著低于复合生态系统2相应植株上的个体数量.转基因杨树上叶甲类累计个体数量显著高于非转基因杨树上的,寄生蜂类累计个体数量则显著低于非转基因杨树上的.在6月5日、6月21日和9月7日的调查中,转基因杨树上的节肢动物群落香农指数显著高于非转基因杨树上的.除鳞翅目害虫外,2个复合系统中棉株上节肢动物各功能群累计个体数量无显著性差异,香农指数、优势集中性指数和均匀度指数随时间变化的趋势基本一致且同一调查时间无显著性差异,仅在8月17调查中复合生态系统1中棉株上节肢动物香农指数显著高于复合生态系统2棉株上的.将杨树和棉花上节肢动物各类群累计数量相加作为系统整体,复合生态系统1和复合生态系统2在香农指数、优势集中性指数和均匀度指数数值上无显著差异.在调查后期,2个复合系统中节肢动物种群均向杨树叶片聚集.转基因棉花叶片Bt蛋白含量在各调查期均显著高于转基因杨树叶片的.[结论]转基因杨树对靶标害虫种群数量有较好的控制作用,对同系统内棉花上鳞翅目害虫数量亦有协同控制作用.转基因杨棉复合系统中地上节肢动物群落结构稳定,对系统内棉花地上部节肢动物群落多样性无显著影响.靶标害虫对转Bt基因杨树的抗性发展需持续监测.

D型细胞周期蛋白(D-type cyclin)调控着细胞周期G1/S的转变,在植物生长发育过程中发挥重要作用.转基因杨树PtoCYCD2;1(OE-PtoCYCD2;1)植株出现明显的表型变化,株高降低,茎粗变细且叶片发生卷曲.该研究以转基因杨树OE-PtoCYCD2;1为研究材料,通过转录组学测序和生理指标变化并结合植株表型特征分析PtoCYCD2;1在植物生长发育中的功能,为研究木本植物D型细胞周期蛋白功能提供理论基础.结果表明:(1)在OE-PtoCYCD2;1中共鉴定得到1 269个差异表达基因,其中有700个上调表达,569个下调表达.分析发现,有26个属于AP2/ERF转录因子的基因上调表达;有8个下调的差异表达基因富集在木质部合成通路中;在碳代谢通路中共富集27个下调差异表达基因,其中有8个基因富集到卡尔文循环通路中.(2)qRT-PCR实验结果显示,9个差异表达基因的qRT-PCR结果与RNA-seq测定的表达水平变化趋势一致,表明所用RNA-seq结果可靠.(3)生理指标分析发现,与野生型(WT)相比,转基因杨树OE-PtoCYCD2;1的幼叶和成熟叶的总叶绿素含量分别增加57.36％和78.22％;成熟叶的可溶性糖含量下降了 12.72％;幼叶和成熟叶中的木质素含量分别下降了 4.48％和8.03％;幼茎和成熟茎中的木质素含量分别下降了 20.03％和31.63％.研究认为,转基因杨树OE-PtoCYCD2;1通过影响杨树碳代谢和木质素合成过程中相关基因的表达,从而造成转基因植株相应代谢物含量减少,最终导致植株表型改变,总体生物量降低.

目的:WIND(WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION),是属于 ERF/AP2(ETHYLENE RESPONSE FACTOR/APETALA 2)家族的一种重要转录因子,该类基因最早被发现在拟南芥中可以与乙烯响应元件GCC-BOX和脱水响应元件DRE结合,响应干旱信号和调节乙烯水平.最近的研究发现WIND基因在植物伤口信号回应、愈伤组织形成及不定芽的产生过程中也发挥了关键作用.已有的研究阐述了WIND基因在拟南芥中控制愈伤组织形成及不定芽再生的机制,但其在木本植物中的功能尚不明确,将探究WIND基因在胡杨中与伤口信号响应及不定芽再生相关的功能,同时为在分子水平上解决胡杨再生问题提供理论依据.方法:采用基因克隆、qRT-PCR、转基因表型分析等方法研究WIND基因在胡杨外植体伤口响应和再生不定芽过程中的作用.结果:克隆胡杨WIND家族中的基因PeWIND1和PeWIND2,发现其编码区序列长度分别为1 050 bp和1032 bp,编码349个和343个氨基酸,亚细胞定位均在细胞核中.组织特异性分析显示PeWINDl和PeWIND2在胡杨根、茎、叶、愈伤组织中均有表达,且在愈伤组织中表达量最高.时间表达特异性显示,在经伤口刺激后的24 h内,PeWIND1和PeWIND2基因均呈现先升高后降低的表达趋势,且均在伤口刺激后l h达到表达量峰值.转基因植株表型统计发现,过表达PeWIND1和PeWIND2基因后转基因植株不定芽再生能力增强.结论:在胡杨叶片有伤口刺激后,PeWIND1和PeWIND2响应伤口信号,表达量先升高后降低,PeWIND1和PeWIND2能够促进杨树茎段再生不定芽.