微生物合成生物学的重要内容包括挖掘和解析生物合成系统的基本元件,设计和构建具有优良特性的底盘细胞,为微生物药物的高效生物合成奠定理论基础,为微生物药物产业化和新药创制提供强大的支撑.综述了链霉菌较小基因组细胞(底盘)的构建方法、评估、应用等相关研究,提出了链霉菌较小基因组细胞系统设计理念、高版本工业链霉菌底盘构建思路及其评估体系,并探讨了高版本工业链霉菌底盘高效生物合成重要植物源化合物(青蒿素、紫杉醇、番茄红素等)的产业应用前景.

[目的]本研究旨在以来源于林可链霉菌NRRL2936中的nosokomycinB2的生物合成基因簇(noso-BGC)为基础,组装获得完整的福林霉素生物合成基因簇(pho-BGC),再利用异源表达策略,激活pho-BGC的表达并通过底盘宿主的优选实现福林霉素发酵产量的提升.[方法]首先,在林可霉素基因簇缺失突变株JCK126基因组中,整合了福林霉素生物合成所缺失的moeA4、moeB4和moeC4 3个环合成基因(来源于加纳链霉菌ATCC 14672),通过对重组菌株LX19的发酵和提取物的检测确认了 pho-BGC在林可链霉菌中的沉默表达.然后,利用基因组装技术将moeA4、moeB4和moeC4 3个环合成基因与noso-BGC进行连接,得到了含有完整pho-BGC的质粒pJQK572.接着,通过接合转移将质粒pJQK572分别导入Streptomyces coelicolor M1152、Streptomyces lividans SBT18、Streptomyces lividans LJ1018和 Streptomyces coelicolor M1446宿主中获得不同的重组菌株LX20、LX21、LX22和LX23.最后,通过对不同重组菌株进行发酵并对提取物进行生物活性分析以及UPLC-TOF MS检测,确定福林霉素在不同异源宿主中的合成情况,并结合二级质谱分析(ESI-MS2)对其结构进行确定.[结果]pho-BGC在天蓝色链霉菌M1152中成功实现了异源表达,并在4拷贝天蓝色链霉菌M1446中发酵产量提高了约20％.[结论]本研究通过系统的发酵检测确定了福林霉素生物合成基因簇在林可链霉菌中是沉默的;然后,在nosokomycin B2基因簇的基础上,构建了含有完整pho-BGC的质粒pJQK572;获得了 pho-BGC在不同宿主中的异源表达产物后,利用多种液相-质谱联用技术对发酵提取物进行检测,确定了pho-BGC在天蓝色链霉菌M1152中成功表达,接着通过多拷贝整合技术在菌株LX23中将福林霉素的产量提高了约20％.完整pho-BGC的拼接和在菌株LX20&LX23中的异源表达,为福林霉素生物合成机制的探索和高产优化奠定了基础.

[目的 ]土霉素(oxytetracycline,OTC)属于第一代四环素类抗生素,对革兰氏阳性菌和阴性菌具有很好的抑菌效果,目前主要应用于畜牧业、水产养殖业和作为原料药生产二代、三代四环类抗生素.因此,在生产上具有提高产量、降低成本的迫切需求.为了解决工业菌株改造中面临着遗传操作比较困难、周期长的问题,我们通过异源重构白色链霉菌(Streptomyces albus)De114并作为底盘生产菌株,进而评估该菌株OTC生物制造细胞工厂的潜力.[方法]通过理性工程重构,获得一系列衍生菌株 De114:Oxy、Del14:Oxy1K、De114:Oxy1K△otrR,De114B:Oxy1K△otrR.对上述菌株进行摇瓶发酵以及HPLC检测发酵产物;通过RT-qPCR检测OTC生物合成基因簇(otc cluster)相关结构基因的转录水平.[结果]S.albus Del14生长快、不结球,对OTC具有一定的耐受性.通过操纵簇内调控因子OtcR和OtrR,最终使重组菌株Del14B:Oxy1K△otrROTC产量在第6天达到了 1.1 g/L,与原始生产菌株龟裂链霉菌(S.rimosus)M4018在第8天产量相当.[结论]本研究首次在S.albus De114中异源表达了土霉素生物合成基因簇,初步证实了一个很有潜力的OTC生物制造底盘,为这一OTC生产菌株的进一步优化改造奠定了基础.

[目的 ]Ⅰ型羊毛硫肽通常具有广泛的生物活性,且抑菌机制独特,较少产生耐药性,因而在临床上具有很好的应用前景.本文对Streptomyces coelicolor A3(2)基因组上2个新颖的Ⅰ型羊毛硫肽生物合成基因簇进行研究,以实现目标羊毛硫肽的表达.[方法]首先,通过antiSMASH分析S.coelicolor A3(2)基因组序列,挖掘羊毛硫肽生物合成基因簇,使用BLAST进行基因功能注释,选择可能参与生物合成过程的基因;然后利用基因组装技术构建异源表达质粒,通过接合转移在链霉菌底盘细胞中进行异源表达;最后对发酵产物进行高效液相色谱、质谱及生物活性检测.[结果]通过添加启动子元件重构S.coelicolor A3(2)上基因簇3(8.9 kb)和基因簇24(9.0 kb),得到pYES-ColE1-SCO-cluster3 和 pYES-ColEl-SCO-cluster24.pYES-ColE1-SCO-cluster3 在底盘细胞Streptomyces coelicolor M1152 和 Streptomyces sp.A14 中成功表达,得到潜在目标化合物 coelin 3;pYES-ColE1-SCO-cluster24在底盘细胞Streptomyces sp.ZM13中成功表达,得到潜在目标化合物coelin 24.其中 coelin 3 对 Bacillus subtilis 168 和 Escherichia coli ATCC 25922 具有抑制作用,并且抑菌圈均达到28mm.[结论]本研究成功使用启动子激活和异源表达策略实现了 coelin3和coelin24的表达和活性测试,为后续新颖的羊毛硫肽结构解析和作用机制研究奠定了基础.

[目的]本研究旨在通过将琼脂糖包埋染色体DNA的方法与ExoCET重组技术相结合,建立放线菌天然产物生物合成基因簇的捕获方法.然后将克隆基因簇导入通用底盘宿主中,实现目标生物合成基因簇的异源表达.[方法]首先,利用低熔点琼脂糖包埋技术制备菌株的染色体基因组总DNA,再用限制性内切酶消化含有染色体DNA的琼脂块,获得线性化的DNA样品;然后利用ExoCET重组技术,以p15A线性载体片段将目标基因簇线性片段进行捕获;再通过PCR-targeting的方法向目标质粒中引入所需的接合转移DNA元件.接着,将改造质粒通过接合转移导入到StreptomycescoelicolorM1252宿主中,获得不同的重组菌株.最后,对不同的菌株进行发酵并提取化合物,最后进行活性检测以及质谱检测.[结果]通过该方法,从菌株S.lincolnensis NRR2936中成功获得了林可霉素生物合成基因簇(lmb-BGC),从菌株Nonomuraea nitratireducens WYY166T中克隆得到了 2个核糖体肽类化合物的生物合成基因簇(nioblantin,niob-BGC和nitblantin,nitb-BGC),并实现了lmb-BGC在天蓝色链霉菌M1252中的成功表达.[结论]本研究通过将低熔点琼脂糖包埋技术与ExoCET重组技术进行合理整合,定向克隆得到了林可霉素以及2个新颖的羊毛硫肽类化合物的生物合成基因簇.然后,分别对重组质粒改造后,在天蓝色链霉菌M1252宿主中进行表达,分别获得重组菌株MJX01、MJX02和MJX04.最后,利用质谱以及活性测试的手段对发酵提取物进行了检测,确定了林可霉素生物合成基因簇在天蓝色链霉菌M1252中成功表达.本研究为通过基因簇克隆和异源表达发掘新化合物奠定了基础.

[目的]本研究旨在通过定向克隆菌株Nonomuraea candida HMC10T中一个新的Ⅱ型套索肽类生物合成基因簇,通过在放线菌底盘宿主中的异源表达,获得新结构套索肽noncaromin,并完成其抑菌活性分析.[方法]通过antiSMASH软件分析菌株N.candidaHMC10T全基因组序列,确定新的 Ⅱ 型套索肽 noncaromin 的生物合成基因 簇(biosynthetic gene cluster of noncaromin,nonc-BGC).然后,利用 ExoCET 重组技术(exonuclease combined with RecET recombination)获得完整的nonc-BGC,得到重组质粒pJQK652,并通过λ-Red重组技术改造得到整合型质粒pJQK653.采用接合转移方法,将该质粒分别导入白色链霉菌、2株变铅青链霉菌、2株天蓝色链霉菌和红色糖多孢菌宿主中进行异源表达,再通过发酵和分离纯化获得目标套索肽noncaromin.最后,利用QTOF-ESI-MS2完成套索肽noncaromin的结构鉴定,并通过抗菌活性检测确定该化合物的生物活性.[结果]本研究利用ExoCET技术成功获得了完整的nonc-BGC,在6种放线菌宿主中成功异源表达,完成了 noncaromin的结构鉴定,确定了其具有微弱的抗枯草芽孢杆菌活性.[结论]本研究在克隆得到新结构套索肽nonc-BGC的基础上,实现了该基因簇在6个放线菌底盘宿主中的成功表达,获得了 1个具有微弱抑制枯草芽孢杆菌活性的新结构Ⅱ型套索肽noncaromin.本研究结果为发掘菌株N.candida HMC10T及其他放线菌中的新结构化合物提供了借鉴.