目的 探讨锌指蛋白750(ZNF750)在子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和迁移中的作用并筛选其调控的潜在靶基因.方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞转染ZNF750过表达质粒(OE-ZNF750组)和ZNF750干扰片段(si-ZNF750组)后ZNF750的mRNA和蛋白质表达水平;细胞计数试剂盒8(CCK8)检测细胞增殖能力,Trans well实验检测细胞的侵袭和迁移能力;基因表达微阵列分析结合生物信息学方法筛选ZNF750调控的候选靶基因.设置对照组(NC组),组间比较采用t检验和非参数检验.结果 上调ZNF750基因第72 h,CCK8实验结果显示,与NC组(5.79±0.20)相比,OE-ZNF750组(4.70±0.10)Ishikawa细胞的增殖能力降低,t=10.571,P＜0.001;Transwell 实验结果显示,NC 组细胞侵袭数为(156.44±7.84)个,迁移数为(125.55±19.69)个,OE-ZNF750组细胞侵袭数为(103.44±19.21)个,迁移数为(49.33±14.15)个,差异均有统计学意义,t值分别为7.660 和 9.428,均 P＜0.001.下调 ZNF750 基因第 72 h,CCK8 实验结果显示,与 NC 组(5.21±0.07)相比,si-ZNF750组(5.59±0.12)Ishikawa细胞的增殖能力升高,t=-5.876,P＜0.001;Trans well实验结果显示,NC组细胞侵袭数为(159.11±32.91)个,迁移数为(84.88±11.47)个,si-ZNF750 组细胞侵袭数为(314.77±24.06)个,迁移数为(181.11±18.01)个,差异均有统计学意义,t值分别为一 11.454和一 13.518,均P＜0.001.通过基因表达微阵列分析筛选ZNF750的下游靶基因,结果显示,上调ZNF750后,有414个差异表达基因,下调ZNF750后,有50个差异表达基因,结合生物信息学筛选出与癌症相关的基因有RAC2、KLF4、FN1、IGF2和MAGEA2.qRT-PCR结果显示,上/下调ZNF750后,与NC组相比,KLF4、RAC2、MAGEA2和IGF2的mRNA表达水平显著升高/降低,FN1的mRNA表达水平显著降低/升高,差异均有统计学意义,均P＜0.05.结论 在子宫内膜癌细胞中,ZNF750作为抑癌基因发挥作用,抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移,RAC2、KLF4、FN1、IGF2和MAGEA2为ZNF750的潜在候选靶基因.

目的 研究锌指蛋白750(ZNF750)调控E2F转录因子2(E2F2)抑制口腔鳞癌CAL-27细胞增殖、迁移的作用及机制.方法 采用BrdU染色研究ZNF750对CAL-27细胞周期的影响;蛋白质印迹法检测细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4、CDK6、活化Caspase-3及E2F2蛋白的表达;Calcein AM与EthD-1共染研究ZNF750对CAL-27失巢凋亡的影响;肿瘤悬浮成球及Transwell实验研究ZNF750对CAL-27细胞自我更新及侵袭迁移的影响;分析E2F2对CAL-27细胞生物学功能的影响.双荧光素酶报告基因分析ZNF750对系列E2 F2启动子截短体的荧光素酶活性的影响;双荧光素酶报告基因实验、CCK-8及细胞划痕实验分别研究野生型及突变型ZNF750对E2 F2荧光素酶活性、细胞活性及迁移的影响.结果 与oe-Con相比,过表达ZNF750可使细胞周期阻滞于G1期〔(50.07±5.74)％,P=0.010〕、S期细胞减少〔(32.15±2.47)％,P=0.003〕,抑制CDK4(0.19±0.01,P<0.001)、CDK6(0.27±0.00,P<0.001)表达;促进活化Caspase-3(0.92±0.02,P<0.001)蛋白表达,促进CAL-27细胞失巢凋亡,并抑制细胞的自我更新(8.67±1.15,P=0.009)、侵袭(80.60±2.52,P<0.001)及迁移(52.33±3.51,P<0.001).然而,干扰ZNF750基因则引起相反的变化.ZNF750的潜在调控靶标E2 F2则可促进CAL-27细胞肿瘤球形成,细胞侵袭、迁移增强,而降低细胞的失巢凋亡.荧光素酶报告基因结果显示,ZNF750可抑制E2F2的荧光素酶活性(0.375±0.031,P=0.007),尤其是Z+ET8(-154→+100)截短体组(0.057±0.007,P<0.001)的活性;在蛋白水平也证实,ZNF750可抑制E2F2蛋白表达(0.26±0.14,P=0.003).此外,突变ZNF750模序(C2H2和PLNLS)则丧失了其对E2F2的调控及对CAL-27细胞活性、细胞迁移的抑制作用.结论 ZNF750主要通过C2H2和PLNLS模序负调控E2F2的表达抑制CAL-27细胞的增殖与迁移.

目的:探讨白头翁汤水煎液通过调控经典Hedgehog(Hh)信号通路诱导人结直肠癌细胞HCT116凋亡的作用及其机制.方法:用白头翁汤(25、50、100、200、500、750、1 000 mg·L-1)处理HCT116细胞24 h,然后用噻唑蓝(MTT)比色法检测白头翁汤对细胞增殖的影响;分别设置空白组、白头翁汤组(125、250、500 mg·L-1)和五氟尿嘧啶(5-FU)组(40 mmol·L-1),显微镜观察细胞给药前后形态变化;划痕实验检测白头翁汤对细胞迁移的影响;Hoechest 33324/碘化丙锭(PI)染色法评价白头翁汤对细胞凋亡的影响;流式细胞术检测白头翁汤对HCT116细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞凋亡相关B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平及Hh信号通路关键因子音猬因子(SHh)、GLI家族锌指蛋白1(Gli1)、G蛋白偶联受体蛋白Smoothened(Smo)、苏氨酸蛋白激酶Fused抑制因子(SuFu)、c-核蛋白类基因(c-Myc)蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Hh通路相关基因SHh、Gli1、Smo、SuFu、c-Myc mRNA表达水平.结果:与空白组比较,白头翁汤组(125、250、500 mg·L-1)HCT116细胞形态发生明显改变,细胞变圆,其增殖被抑制,且呈浓度依赖性,迁移能力下降(P＜0.05,P＜0.01),细胞核出现致密浓染,凋亡数量增加.与空白组比较,白头翁汤(500 mg·L-1)处理HCT116细胞24h,Bax蛋白和mRNA表达水平升高(P＜0.05,P＜0.01),Bcl-2蛋白和mRNA表达水平降低(P＜0.05,P＜0.01).与空白组比较,白头翁汤组(500 mg·L-1)处理24h后,Hh信号通路关键因子SHh、Glil、Smo、c-Myc的mRNA和蛋白水平表达降低(P＜0.05,P＜0.01),Hh信号通路负调控因子SuFu表达水平升高(P＜0.05,P＜0.01).结论:白头翁汤通过降低Hh信号通路活性来抑制结直肠癌细胞HCT116增殖和迁移,诱导癌细胞凋亡.

目的 筛选锌指蛋白750(ZNF750)在口腔肿瘤干细胞样细胞(CSC-like cell)中的潜在靶蛋白.方法 ①CSC-like cell的富集:采用肿瘤球形成实验富集口腔鳞癌(OSCC)细胞系TCA-83及CAL-27细胞中CSC-like cell细胞.② CSC-like cell细胞中ZNF750潜在靶蛋白筛选:将CSC-like cell分为oe-Con组(转导空载体慢病毒)及oe-ZNF750组(转导过表达ZNF750慢病毒),采用TMT标记定量蛋白质组学技术筛选两组差异表达蛋白,对差异表达蛋白进行生物信息学分析[GO、KEGG及IPR(结构域)分析],从差异表达蛋白中选择与ZNF750关系密切的候选蛋白[角鲨烯合酶(FDFT1)、与糖代谢相关的糖原合成酶(GYS1)、与核糖体相关的核糖体蛋白RPL15及40S核糖体蛋白RPS7以及具有结构分子活性的角蛋白6A、17(KRT6A、KRT17)]进行实时荧光定量PCR(qPCR)验证.从与ZNF750关系密切的候选蛋白中选择FDFT1(与类固醇生物合成有关兼具酶转运活性)作为兴趣蛋白,采用qPCR检测CSC-like cell、口腔鳞癌(OSCC)细胞、正常口腔上皮细胞中FDFT1 mRNA的相对表达量,蛋白质印迹法检测过表达或敲减ZNF750基因的CSC-like cell中FDFT1蛋白相对表达量.结果 ①转导过表达ZNF750基因的 CSC-like cell细胞中差异表达蛋白的筛选结果:与oe-Con组相比,oe-ZNF750组中差异表达蛋白共26个,其中上调9个,下调17个.②差异表达蛋白生信分析结果及其中与ZNF750关系密切的差异表达蛋白验证结果:GO分析结果显示,差异表达蛋白主要位于细胞内和细胞内非膜结合细胞器,参与生物合成及生物大分子的合成过程;涉及的生物功能包含结构分子活性、糖原合成酶活性、糖脂转运及糖脂结合功能;KEGG 信号通路分析结果显示,差异表达蛋白显著富集在类固醇生物合成及糖代谢过程中;IPR分析证明富集的结构域包含糖脂转移蛋白结构域.qPCR结果显示,ZNF750可降低FDFT1、GYS1、RPL15、RPS7、KRT6A、KRT17基因的表达(P均＜0.05).③ CSC-like cell及过表达或敲减ZNF750基因的CSC-like cell中 FDFT1蛋白表达变化:与正常口腔上皮细胞比较,OSCC及CSC-like cell中FDFT1的表达上调,以CSC-like cell为著(P均＜0.05).分别与各自匹配的阴性对照组比较,过表达ZNF750的CSC-like cell中FDFT1蛋白表达下调,敲减ZNF750的CSC-like cell中FDFT1蛋白表达上调(P均＜0.05).结论 过表达ZNF750的CSC-like cell中差异表达蛋白共26个,其中上调9个、下调17个;差异表达蛋白主要与生物大分子合成及类固醇生物合成有关;FDFT1可能是ZNF750的潜在靶蛋白.