目的:探讨WNT2B基因高表达成纤维细胞通过激活巨噬细胞促进克罗恩病肠道组织损伤的机制。方法:生物信息分析、病理组织研究及细胞实验研究。生物信息分析方面，收集课题组前期炎症性肠病（IBD）患儿结肠组织细胞生物信息研究数据，再次进行单细胞测序分析。病理组织研究方面，以2022年7至9月于广州市妇女儿童医疗中心消化科住院行结肠镜检查确诊为克罗恩病的10例患儿为研究对象，每例患儿均分别取结肠炎症明显或溃疡部位组织及邻旁炎症轻微或正常部位组织，根据结肠镜下外观显示炎症明显或溃疡部位组织为炎症组，炎症轻且无溃疡部位组织为非炎症组。结肠组织行HE染色观察其病理情况，组织免疫荧光检测巨噬细胞浸润和CXCL12的表达情况。细胞实验研究方面，转染了WNT2B质粒或空载质粒的成纤维细胞分别与有或无经盐霉素处理的巨噬细胞共培养，蛋白质印迹法检测Wnt经典通路蛋白表达情况；使用SKL2001处理的巨噬细胞作为实验组，磷酸盐缓冲液处理的巨噬细胞为对照组，采用实时荧光定量PCR（qPCR）反应、酶联免疫吸附试验检测巨噬细胞CXCL12的表达及分泌情况。组间比较采用 t检验或秩和检验。 结果:单细胞测序分析提示巨噬细胞是IBD结肠组织的主要细胞，高表达WNT2B基因的成纤维细胞和巨噬细胞存在相互作用关系。病理组织研究中，10例患儿［年龄（9.3±3.8）岁，男7例、女3例］的结肠组织HE染色显示，炎症组结肠组织病理评分高于非炎症组［4（3，4）比2（1，2）分， Z=3.05， P=0.002］，组织免疫荧光提示每高倍镜视野中炎症组巨噬细胞浸润数明显高于非炎症组［（72.8±10.4）比（8.4±3.5）个， t=25.10， P<0.001］，炎症组每高倍镜视野中表达CXCL12的细胞明显多于非炎症组［（14.0±3.5）比（4.7±1.9）个， t=14.68， P<0.001］。细胞实验中，蛋白质印迹法提示与转染了WNT2B质粒的成纤维细胞共培养的巨噬细胞磷酸化的糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）水平升高，而盐霉素可逆转这一现象；qPCR提示实验组中CXCL12的转录水平高于对照组（6.42±0.04比1.00±0.03， t=183.00， P<0.001），酶联免疫吸附试验显示实验组中CXCL12的表达及分泌水平高于对照组［（465±34）比（77±9）ng/L， t=13.21， P=0.006］。 结论:WNT2B基因高表达成纤维细胞分泌WNT2B蛋白，激活巨噬细胞Wnt经典信号通路，从而促进巨噬细胞CXCL12的表达和分泌，诱导克罗恩病肠道炎症的发展。

目的 探究中草药提取物川藏香茶菜丙素(Iso C)对NLRP3炎症小体活化的影响以及对脂多糖(LPS)诱导的小鼠脓毒性休克是否具有缓解作用.方法 体外实验:利用LPS预刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)以及人急性单核细胞白血病(THP-1)细胞系.通过加入多种NLRP3炎症小体激动剂活化经典NLRP3炎症小体.利用胞内转染LPS活化非经典NLRP3炎症小体.利用转染聚脱氧腺苷酸(poly A:T)活化AIM2炎症小体.通过蛋白质印迹法(Western blot)检测NLRP3炎症小体活化产物caspase-1的剪切,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测上清中NLRP3依赖与非依赖的多种促炎细胞因子分泌情况.利用电感耦合等离子体发射光谱仪检测细胞内钾离子含量.体内实验:挑选SPF级C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组(Control组),脓毒性休克组(LPS组),Iso C治疗组(LPS+Iso C组).ELISA分析小鼠血清和腹腔灌洗液中促炎细胞因子白细胞介素1β(1L-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的分泌情况,并观察注射LPS后小鼠48h内生存时间,绘制小鼠生存曲线.结果 体外实验表明,在BMDM细胞中Iso C以剂量依赖的方式抑制多种激动剂引起的经典NLRP3炎症小体活化以及胞内转染LPS诱导非经典NLRP3炎症小体的活化(P<0.05),Iso C对NLRP3炎症小体非依赖的促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌无显著影响(P>0.05).Iso C对AIM2炎症小体的活化无显著影响(P>0.05).Iso C不影响NLRP3炎症小体活化上游信号钾离子外流(P>0.05).在人THP-1细胞中Iso C抑制NLRP3炎症小体活化(P<0.05).体内实验结果表明,与脓毒性休克组相比,Iso C治疗组小鼠血清和腹腔灌洗液中IL-1β的水平显著下降(P<0.05)且生存时间更长(P<0.05).结论 中草药来源的Iso C可以特异性抑制NLRP3炎症小体的活化从而缓解小鼠脓毒性休克,是潜在的治疗炎症性疾病的小分子化合物.

目的 分析和预测华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白(CsNOSIP)基因序列结构和功能特征及其编码蛋白的理化性质,预测该基因的生物学意义.方法 利用生物信息学方法(Vector NTI、InterProScan、SignalP和SecretomeP等相关软件)对华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白基因及相应氨基酸序列的同源性、理化性质、保守结构域、信号肽、亲水性/疏水性、B细胞表位进行预测分析.结果 华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白基因的开放阅读框包含867 bp,编码288个氨基酸,理论分子质量为35 Mr,等电点为9.16.SignalP和SecretomeP分析结果显示华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白为非经典途径分泌蛋白;InterProScan分析结果显示,华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白特征性结构域位于第45～76位,第211～267位和第1～289位氨基酸之间.在该基因的氨基酸序列中,共发现7个B细胞表位.结论 利用生物信息学知识和各种分析软件对CsNOSIP所编码的cDNA序列及理论蛋白质的理化性质、结构和功能域等进行预测和分析,能够为开展CsNOSIP的表达及其功能研究提供理论依据.

以 IL-32蛋白为研究对象,对其氨基酸序列结构特点、翻译后修饰及蛋白网络互作进行生物信息学预测和分析.方法:利用多种生物信息学在线软件对 1L-32蛋白理化性质、信号肤、跨膜结构、亚细胞定位及蛋白网络互作进行预测分析.结论:IL-32为不稳定亲水性蛋白,不具有典型的信号肤,不存在跨膜区,既不是经典型分泌蛋白,也不是非经典型分泌蛋白,作用部位为细胞质、细胞核、线粒体、细胞骨架和高尔基体;可能有 12个蛋白激酶磷酸化位点、及至少 1 个 O-糖基化位点;与 PRTN3,CXCL8等 10个蛋白质存在相互作用关系.IL-32蛋白结构及功能等的预测分析,为下一步研究其在生命活动及疾病发生中的功能机制提供了理论依据.

在真核细胞中,内质网是最为丰富的膜性细胞器,不仅负责胞内钙离子的稳态调节,而且是膜蛋白和分泌蛋白折叠加工、糖脂合成及其转运的重要场所.当蛋白质合成折叠的负荷超出内质网的加工能力,或者错误折叠蛋白的过度积累都会引发内质网应激,从而激活细胞的未折叠蛋白响应.内质网跨膜蛋白IRE1α、PERK和ATF6介导3条经典的未折叠蛋白响应通路,在缓解内质网应激、维持细胞功能稳态、调控细胞生死命运等过程中发挥至关重要的作用.肝细胞含有大量的光面和糙面内质网,能够感应不同营养代谢状况的变化和外界刺激,通过激活未折叠蛋白响应信号通路参与机体的糖脂代谢调控.内质网应激在代谢调控和肝脏疾病的发生发展中扮演十分重要的角色.该综述总结近年来未折叠蛋白响应与肝脏糖脂代谢领域的研究进展,探讨内质网应激与糖脂代谢紊乱及相关代谢性肝病之间的机制关联,以期深入了解肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等重大慢性疾病的分子病理学基础.

目的 建立一种快速、高效提取肿瘤患者血浆外泌体的新方法 .方法 采用ExoQuick新型纳米材料分离外泌体,考马斯亮蓝染色进行蛋白定量,透射电子显微镜观察外泌体的形态.蛋白质印迹法分析外泌体标记和肝细胞癌相关蛋白.结果 以纳米材料为基础的新提取方法 分离出的胞外泌体直径为30～100 nm,与传统方法 分离的外泌体直径相似;蛋白浓度是传统方法 提取的外泌体蛋白浓度的19倍;鉴定到典型的外泌体蛋白:跨膜蛋白CD63和热休克蛋白70(HSP70).肝细胞癌患者外泌体中含有TGM2,而无膜联蛋白A2表达.结论 基于纳米材料提取外泌体方法 快速有效.肝癌相关蛋白TGM2可以通过外泌体介导的非经典分泌途径分泌,可能是一种有价值的肿瘤标志物.

革兰氏阳性菌通过分泌毒力因子入侵宿主细胞引起化脓性炎症,进而导致疾病的产生,威胁人类健康.识别分泌蛋白有助于了解细菌分泌系统和致病机理,并为进一步筛选出毒力因子奠定基础.由于非经典分泌蛋白质缺乏经典信号肽序列,大规模实验鉴定此类蛋白质相对困难并且耗时耗力.目前,虽相继提出了一些计算预测方法,但它们对革兰氏阳性菌非经典分泌蛋白质的预测性能并不令人满意.本文提出了 一个集成学习模型——SPNG+(Stacking ensemble method to Pre-dict Non-classical secreted proteins in Gram-positive bacteria),该模型通过 stacking 策略融合朴素贝叶斯、随机森林、支持向量机、两个梯度提升树XGBoost和LightGBM以及K近邻算法.五折交叉验证和独立数据集测试结果表明,此集成模型在预测革兰氏阳性菌非经典分泌蛋白质时综合性能优于单一模型、简单的集成学习模型和已有的预测工具.相较过去仅用有限的特征编码方法,或者单一机器学习算法进行构建的预测器,本文提出的方法是对革兰氏阳性细菌中非经典分泌蛋白质研究的有益补充.SPNG+的源代码可以通过https://github.com/weidai00/SPNG获得.

目的 通过生物信息学的方法对DPP4基因与蛋白进行系统的分析,为DPP4在病毒侵入宿主细胞和连花清瘟胶囊等药物防治等方面的研究打下生物信息学基础.方法 首先分析DPP4蛋白的亲疏水性、信号肽结构、跨膜结构等基本性质,再通过SOPMA、SWISS-MODEL、STRING、MEGA-X等软件分析蛋白质的结构、相互作用关系、进化关系等高级属性进行分析,并通过其性质和属性分析DPP4在病毒侵入和药物治疗原理方面的作用.结果 DPP4是一个亲水性非经典分泌蛋白,具有一个跨膜结构,并在小肠中表达较为丰富,在细胞中主要分布在内质网.DPP4的翻译后修饰位点较多,三级结构呈较为特殊的哑铃形,蛋白主要涉及糖代谢调控、炎性反应以及病毒侵入宿主细胞等生物过程.人类DPP4蛋白与啮齿类动物DPP4蛋白的亲缘性较差.结论 连花清瘟胶囊对DPP4具有明确的靶向作用,并且DPP4蛋白与病毒侵入人体密切相关,因此其对病毒性肺炎的防治效果是可靠且明确的.