目的:初步探讨大段骨缺损移植组织工程骨(TEB)后，Arpin蛋白介导的宿主骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移至移植区参与骨修复的作用。方法:免疫荧光观察BMSCs中Arpin蛋白和肌动蛋白相关蛋白2/3(Arp2/3蛋白)的表达及相对定位。构建干扰Arpin蛋白表达慢病毒，转染BMSCs，通过qRT－PCR和Western blot检测Arpin的抑制水平。按照Arpin蛋白表达含量不同，分为空载体对照组和Arpin表达抑制组进行体外和体内实验。体外实验：用迁移小室建立细胞迁移模型，上室接种空载体对照组和Arpin表达抑制组细胞，荧光显微镜检测细胞迁移数量；6孔板接种空载体对照组和Arpin表达抑制组细胞，建立"伤口愈合实验"模型，显微镜检测"伤口愈合"情况。体内实验：选取8周龄C57BL/6小鼠，所有小鼠按照随机数字表法分为空载体对照组(6只)和Arpin表达抑制组(6只)。切除股骨中段2 mm骨干和骨膜，制作大段骨缺损并移植TEB模型。每只小鼠经尾静脉注射100万个BMSCs细胞，术后2, 7 d免疫荧光染色检测BMSCs迁移至骨缺损区数量的差异。术后4周，取股骨进行Micro－CT扫描，检测骨密度(BMD)、相对骨体积(BV/TV)、骨小梁间距(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)，然后标本进行病理HE和Masson染色，观察成骨质量。结果:小鼠BMSCs表达Arpin蛋白，相对于Arp2/3，其定位在细胞边缘。在转染慢病毒后，BMSCs表达绿色荧光蛋白，并且Arpin表达抑制组Arpin基因及蛋白表达较空载体对照组显著降低( P<0.01)。体外细胞迁移实验中，Arpin表达抑制组细胞迁移数量[(105.7±6.5)个]较空载体对照组[(76.6±6.6)个]高( P<0.01)。"伤口愈合实验"中，Arpin表达抑制组"伤口愈合"百分比[(62.6±3.2)%]较空载体对照组[(43.8±1.9)%]高( P<0.01)。体内实验的免疫荧光结果表示，术后2 d，两组迁移细胞计数差异无统计学意义( P>0.05)，几乎无标记细胞迁移；术后7 d，Arpin表达抑制组细胞迁移至移植区的数量[(11.3±1.5)个]较空载体对照组[(5.7±1.5)个]更多( P<0.01)。术后4周，Micro－CT结果显示，相对于空载体对照组[BMD：(140.0±6.0)mg/cm 3，BV/TV：(23.4±0.9)%，Tb.Sp：(0.28±0.01)μm ，Tb.Th：(0.15±0.01)μm ], Arpin表达抑制组[BMD：(172.7±6.0)mg/cm 3，BV/TV：(28.8±1.3)%，Tb.Sp：(0.33±0.01)μm，Tb.Th：(0.11±0.01)μm]成骨质量更高( P<0.05)；病理染色提示，Arpin表达抑制组存在更多的新生骨组织。 结论:沉默Arpin蛋白的表达会促进BMSCs的迁移，增加宿主BMSCs迁移至骨缺损区域，提高骨修复效果。

目的:探究人牙槽窝肉芽组织的细胞组成与异质性并构建单细胞图谱，解析肉芽组织在炎性微环境下通过自然转归的潜在结局。方法:纳入2022年9月至2023年8月就诊于第四军医大学口腔医院颌面外科，因中、重度牙周炎行牙拔除术并拟行延期位点保存术或自体牙移植术的患者12例，收集其牙槽窝肉芽组织，分别用HE染色和单细胞转录组测序技术（ScRNA-seq）观察不同类型肉芽组织细胞构成、组织形态学变化，获得特定微环境下的炎性牙槽窝肉芽组织细胞序列差异，构建出人牙槽窝不同类型肉芽组织的单细胞图谱，并探索炎性肉芽组织转归过程中细胞类型分布及关键基因变化的时空规律。结果:HE染色显示，牙槽窝炎性肉芽组织中含有大量炎性细胞浸润，保留炎性肉芽组织待自然转归3周后，其组织学形态与修复性肉芽组织愈合形态基本一致。ScRNA-seq共捕获肉芽组织细胞20 448个，基因表达定量检测分析炎性肉芽组织、自然转归性肉芽组织及修复性肉芽组织基因总数分别为33 835、36 058、34 719个。肉芽组织在单细胞水平被注释为血管内皮细胞、间充质干细胞、成纤维细胞等10个细胞亚群。炎性肉芽组织与自然转归性肉芽组织在细胞组成占比存在差异。拟时序分析展示了肉芽组织中免疫反应与血管新生参与组织转归愈合的两种主要结局。参与炎症调控和免疫反应的基因胰岛素样生长因子结合蛋白 5（Igbp5）、锌指蛋白（Zfp36）和热休克蛋白（Hspa1b），以及参与细胞外基质分泌及血管、纤维形成的相关基因组织金属蛋白酶抑制因子3（Timp3）、骨膜蛋白（Postn）和G蛋白信号调节因子5（Rgs5）在两种肉芽组织中的表达存在显著差异。结论:炎性肉芽组织在细胞组成占比、基因表达、生物学功能等方面与自然转归性肉芽组织存在异质性，不刮除牙槽窝炎性肉芽组织待其自然转归后在组织学及单细胞水平展现出与修复性肉芽组织相似的细胞结构组成，并通过免疫反应及组织重塑调节炎症反应及愈合过程。

目的:探究人与非人灵长类动物（恒河猴）的下颌骨骨膜中是否存在有别于传统间充质干细胞的干细胞群体及其在膜内成骨过程中的特性，并提供区别于其他解剖区域骨膜干细胞（PSC）的下颌骨PSC的稳定分离、培养、扩增的标准化流程。方法:分别从上海交通大学医学院附属第九人民医院的18~24岁行第三磨牙拔除术3例患者翻瓣去骨过程中的骨块表面和3只6岁龄恒河猴下颌骨的磨牙区颊侧获取骨膜，使用Illumina平台Novaseq 6000测序仪进行单细胞测序，并通过同源基因匹配进行跨物种单细胞转录组测序的结果比较。使用37 ℃和低温两种消化方式从原代组织中分离PSC，经流式细胞术分析鉴定其表面标志物（CD200、CD31、CD45和CD90）并通过免疫荧光鉴定组织蛋白酶K（CTSK）与CD200的共定位情况。评估体外扩增至第3代的不同物种PSCs的细胞增殖能力和三系分化能力。比较PSC和骨髓间充质干细胞（BMSC）在成骨方面的特性异同。结果:单细胞测序结果提示直系同源基因匹配降维后获得了18个聚类的细胞群，基于各细胞标志物数据库对各聚类进行细胞注释。低温消化方案可以稳定地从人、恒河猴下颌骨骨膜中分离出PSC，细胞呈成纤维细胞状。细胞计数法结果显示人与恒河猴的PSC增殖能力差异无统计学意义，流式细胞术分析鉴定结果显示，从骨膜分离的细胞表面抗原表达CD200 +、CD31 -、CD45 -和 CD90 -，免疫荧光提示CTSK与CD200共定位于此细胞中。茜素红染色、油红O染色和阿尔辛蓝染色结果显示，人和恒河猴的PSC均具备成骨、成脂、成软骨的分化能力。与BMSC的成骨能力相比，PSC增殖能力略优，分化过程中，PSC在早期有良好的成骨表现。 结论:本研究成功稳定分离并鉴定出人和非人灵长类动物（恒河猴）的正常下颌骨PSC，为探索下颌骨膜内成骨的机制、建立理想的非人灵长类动物模型以及下颌骨缺损修复新型策略提供了细胞学基础。

目的 探讨人脐带间充质干细胞(huc-MSC)来源外泌体(Exo)对小鼠胫骨骨折的修复作用及可能机制.方法 于2018年12月至2022年1月,体外分离、培养hucMSCs,超速离心法收集Exo并鉴定.24只8周龄雄性C57BL/6J小鼠行胫骨骨折,并采用随机数字表法分为模型对照组、磷酸缓冲盐溶液(PBS)对照组及huc-MSC-Exo组,每组各8只,其中huc-MSC-Exo组小鼠骨髓腔内注射huc-MSC-Exo(100 μg溶解于100 μL PBS),PBS对照组小鼠注射等量PBS,模型对照组小鼠不进行处理.21 d后,X线观察骨折愈合情况;双能X线检测骨矿物质密度(BMD);苏木精-伊红(HE)染色观察胫骨组织学变化;免疫组织化学染色检测骨折区骨组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)阳性表达情况;蛋白质印迹法检测骨折区骨组织中VEGFA、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨形成蛋白2(BMP-2)和骨桥蛋白(OPN)蛋白表达水平.结果 经鉴定,成功提取huc-MSC-Exo;模型对照组和PBS对照组小鼠胫骨骨折断端明显、骨膜增厚,骨折带的两侧可见大量未分化的间充质细胞及部分软骨细胞,骨痂的软骨内骨区域软骨细胞形态肥大,而huc-MSC-Exo组小鼠胫骨骨折区愈合明显,外侧骨皮质连续性良好,部分软骨细胞已被吸收,膜内成骨区域出现骨痂;另与模型对照组(VEGFA 0.23±0.02)比较,PBS对照组(VEGFA 0.24±0.02)无明显变化(P>0.05),huc-MSC-Exo组小鼠胫骨骨折断端恢复良好,骨折线基本消失,同时骨折愈合评分、BMD、VEGFA IRS评分、VEGFA(0.48±0.04)、RUNX2、BMP-2和OPN蛋白相对表达水平均升高(P<0.05).结论 huc-MSC-Exo可加快小鼠胫骨骨折修复,其作用机制可能与提高VEGFA表达水平,促进血管生成有关.

目的:探讨牵张力作用对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力的影响及作用机制.方法:原代分离并培养小鼠BMSCs,并将BMSCs分为对照组、牵张力作用6h组、牵张力作用12h组和牵张力作用12h +雷帕霉素(Rap)组,采用多单元细胞拉伸装置施加动态牵张力进行干预.生化法检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性;ELISA法检测细胞培养液上清中骨膜蛋白(POSTN)含量;RT-qPCR检测细胞中Runt相关转录因子 2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、Osterix 和骨桥蛋白(OPN)mRNA 表达水平;Western blot 检测细胞中RUNX2、OCN、Osterix、OPN、POSTN、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达水平.结果:与对照组比较,牵张力作用 6h组和 12h组细胞中ALP活性及RUNX2、Osterix、OCN和OPN mRNA表达水平均显著升高(均P<0.05),上清液POSTN含量、细胞中POSTN蛋白及p-mTOR/mTOR蛋白比值也显著升高(均P<0.05),且牵张力作用12h组更明显.与牵张力作用12h组比较,牵张力作用12h + Rap组细胞中ALP活性和RUNX2、OCN、Osterix、OPN mRNA及蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05),而细胞培养液上清中的POSTN含量无明显差异(P>0.05).结论:牵张力通过介导POSTN表达调控mTOR信号通路激活,从而促进BMSCs成骨分化.

骨修复是一个复杂的过程,包括组织、细胞和分子水平上的生物事件.骨折愈合主要分为炎症、修复和重塑三个生理过程.在修复过程进展中最主要的事件是骨骼干细胞的募集、增殖、扩张和积聚.骨骼干细胞主要源于骨膜等局部骨组织,但是在骨膜损伤较严重的情况下骨修复仍然可以进行.研究发现,机体还存在其他潜在的干细胞来源,从而对缺失和损伤的骨骼干细胞进行补偿.鉴于肌肉与骨骼相邻,且与骨骼的生长发育密切相关,近来肌肉组织又被研究认为是分泌器官.因此,肌肉组织是骨修复细胞和生长因子的重要来源.本文通过论述肌肉组织作为骨骼干细胞的来源,其分泌的肌肉因子以及自身作为重要元件对骨修复的作用,以期望为骨科治疗提供新的见解.

目的:探讨周期性机械离心应力刺激对兔骨膜细胞与骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨矿化的影响.方法:取兔颅骨骨膜细胞、股骨骨髓细胞体外原代培养,传至第3代后分为加力组和对照组.加力组使用低速离心机加载离心力(10 min/d),分别为170、210、250 g.对照组置于超净台(10 min/d)常规培养1、3、5、7、9 d.测定各组细胞成骨矿化能力、ALP活力及细胞增殖情况;实时荧光定量PCR法测定两种细胞成骨相关基因骨钙素(OCN)和RUNX2的mRNA相对表达量.结果:在不同周期性机械离心力的刺激下,骨膜细胞和BMSCs的增殖活性、ALP活性均有不同程度的提高;其中两种细胞250 g组的增殖活性、ALP活性升高显著(P<0.05);骨膜细胞和BMSCs的加力实验组,除BMSCs 210 g组的矿化结节数目与对照组相比无统计学差异外(P>0.05),其余各组形成的矿化结节数目、OCN和RUNX2的mRNA相对表达量均较对照组显著增加(P<0.05).结论:适宜大小的周期性机械离心力刺激可促进兔骨膜细胞、BMSCs体外增殖和矿化.

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在25年前被正式命名[1],它代表了一类可从人和哺乳动物的骨髓和骨膜中分离出来的细胞,它们在体外培养扩增后可以保持在诱导剂下形成各种中胚层细胞和组织的能力(图1).体外形成骨、软骨、脂肪等的能力是鉴定这一类多能细胞的方法[9].20世纪90年代有几家公司开始开发MSC产品用于再生医学.开始的时候,很多人不认可在骨髓中有这类干/祖细胞的概念.今天,有数百个诊所[10]采用MSC进行治疗;有数百个MSC的临床试验在进行中[11].但只有极少数的临床应用是基于这些细胞的体外多能性的.

背景:在非接触共培养条件下,软骨细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞.骨膜细胞作为软骨修复的种子细胞,其与软骨细胞共培养的作用及影响鲜有研究.目的:通过软骨细胞与骨膜细胞非接触共培养,利用软骨细胞诱导骨膜细胞向软骨细胞分化.方法:采用胰酶、Ⅱ型胶原酶消化法分离兔关节软骨细胞;组织块培养法分离兔骨膜细胞.分别取第2代软骨细胞和骨膜细胞,按1:1比例通过 transwell 培养板进行非接触共培养作为实验组,单纯骨膜细胞培养作为对照组.培养2周后,倒置显微镜观察2组细胞形态; Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色检测2组细胞的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成;RT-PCR检测2组细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1和性别决定区Y框蛋白9 mRNA表达水平.结果与结论:①培养2周后,实验组共培养骨膜细胞逐渐变为类圆形软骨细胞形态,对照组骨膜细胞仍为长梭形;②实验组共培养骨膜细胞的Ⅱ型胶原免疫组化、甲苯胺蓝染色均为阳性,对照组为阴性;③RT-PCR结果显示,实验组共培养骨膜细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1、性别决定区Y框蛋白9 mRNA相对表达量明显高于对照组;④结果提示,非接触共培养条件下,软骨细胞可以诱导骨膜细胞向软骨细胞分化.

目的 探讨创伤后骨缺损组织工程骨(TEB)移植后,组织工程骨募集宿主骨髓间充质干细胞(BMSCs)参与骨重建的机制. 方法 体内实验:取8周龄FVB/N小鼠,切除股骨干中部2 mm骨干和骨膜,制作大段骨缺损.缺损处分别植入脱钙骨基质(DBM)和TEB并固定,所有小鼠按随机数字表法分为DBM组(18只)和TEB组(18只).移植后24 h流式细胞术评价宿主BMSCs入血的数量,活体动物体内成像观察两组募集循环中小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)到达损伤区域的能力,ELISA法比较两组外周血中基质细胞衍生因子-1(SDF-1)含量.体外实验:(1)迁移小室实验评估SDF-1(100 ng/ml)促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)迁移的能力,SDF-1/趋化因子受体4(CXCR4)通路通过选择性CXCR4拮抗剂普乐沙福(AMD3100)阻断,按处理因素分为对照组、SDF-1组和SDF-1+AMD3100组.(2)建立人脐静脉内皮细胞(hUVECs)、hBMSCs共培养体系并通过SDF-1刺激细胞,按共培养细胞和处理因素分为hBMSCs组、hBMSCs+hUVECs组和hBMSCs+ hUVECs(AMD3100预处理)组.迁移小室实验比较各组hBMSCs迁移数量,ELISA法检测共培养上清的肝细胞生长因子(HGF)水平.(3)对体外培养的hUVECs分别通过SDF-1刺激以及AMD3100拮抗SDF-1/CXCR4,按处理因素分为对照组、SDF-1组和SDF-1+AMD3100组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)评价各组HGF表达. 结果 体内实验:骨缺损材料移植后24 h,TEB组外周血中间充质干细胞(MSCs)数量、SDF-1浓度与DBM组比较均有明显增高(P＜0.05),TEB组募集的术后注射进入循环的mBMSCs多于DBM组(P＜0.01).体外实验:(1)单种细胞迁移小室实验中,相比对照组和SDF-1+AMD3100组,SDF-1组显著增强hBMSCs迁移能力(P＜0.01).(2) hBMSCs和hUVECs共培养体系迁移小室实验中,与hBMSCs组、hBMSCs+hUVECs(AMD3100预处理)组比较,hBMSCs+ hUVEC组迁移细胞数量和HGF浓度均显著增多(P＜0.01),而hBMSCs组与hBMSCs+ hUVECs(AMD3100预处理)组比较差异无统计学意义(P＞0.05).(3) qRT-PCR显示,与对照组比较,SDF-1组HGF表达明显升高(P＜0.01).拮抗SDF-1/CXCR4后,SDF-1+AMD3100组HGF表达与SDF-1组比较显著降低(P＜0.05).结论 骨缺损TEB移植后可以显著提高体内趋化因子SDF-1水平,有效促进宿主MSCs的动员和循环中MSCs的募集.SDF-1不仅通过SDF-1/CXCR4直接促进hBMSCs的迁移,还可上调血管细胞HGF的表达和分泌,进一步放大SDF-1对hBMSCs的趋化作用.