目的:分析静止和循环张应力条件下大鼠髁突软骨细胞（mandibular condylar chondrocytes，MCC）外泌体显著差异微RNA（microRNA，miRNA）的表达谱并探究张应力调节髁突软骨内成骨的作用机制。方法:分别选择5只2周龄雄性SD大鼠（共10只）在静止和循环张应力条件下培养大鼠MCC，提取细胞外泌体，两组外泌体分别命名为对照组和实验组。采用透射电子显微镜、纳米流式检测仪、纳米颗粒追踪分析等方法观察并鉴定，通过高通量测序筛选表达显著差异的miRNA，采用TargetScan、miRanda网站进行生物信息学分析及成骨相关靶基因预测。结果:实验组大鼠MCC外泌体均呈“双凹圆盘状”单层膜结构，CD9、CD81表达阳性，粒径分布符合外泌体特征，与对照组大鼠MCC外泌体一致。高通量测序筛选表达显著差异的miRNA共85个（ P<0.05）。差异miRNA主要参与的生物学过程与分子功能分别为生物学过程和蛋白质结合；京都基因与基因组数据库通路富集分析显示在哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路有显著富集（ P<0.05）。其中miR-199a-5p的候选靶基因有骨形态发生蛋白3（bone morphogenetic protein 3，BMP3）、内皮素转换酶-1，miR-186-5p可靶向Smad8、BMP3，以发挥成骨相关功能。 结论:相比于静止状态，CTS刺激能改变大鼠MCC外泌体中miR-199a-5p、miR-186-5p等miRNA的表达量，可考虑作为调节外泌体应用潜能的一种手段。

目的:观察大鼠颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）髁突软骨细胞自噬功能改变对细胞凋亡的影响。方法:选择雄性2个月龄无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级SD大鼠40只，分为对照组（ n=20）和实验组（ n=20）。实验组所有大鼠均造单侧前牙反 模型模拟TMJOA。8周后处死所有大鼠，并取颞下颌关节，分别提取两组大鼠髁突软骨细胞进行体外培养至第3代。应用免疫荧光技术检测软骨细胞中Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）及细胞自噬水平标志物轻链蛋白-3（light chain-3，LC-3）表达水平；应用免疫组化技术检测细胞糖原累积指标糖原蛋白-1和细胞凋亡指标胱天蛋白酶-3（caspase-3）表达水平。应用Tunel技术检测两组细胞72 h凋亡率。裂解细胞提取全蛋白，应用蛋白质印迹法检测Ⅱ型胶原、MMP-13、LC-3、糖原蛋白-1及胱天蛋白酶-3的表达水平并做灰度分析。 结果:免疫荧光结果显示，与对照组相比，实验组髁突软骨细胞内Ⅱ型胶原和LC-3表达减少，MMP-13、糖原蛋白-1及胱天蛋白酶-3表达均增多。实验组软骨细胞的72 h凋亡率[（17.3±4.4）%]显著高于对照组[（5.6±2.1）%]（ t=10.732， P<0.001）；蛋白质印迹法条带灰度统计结果显示，在实验组软骨细胞内，Ⅱ型胶原表达量（0.43±0.21）显著低于对照组（0.71±0.26）（ t=2.409， P=0.043）；LC-3表达量（0.09±0.04）显著低于对照组（0.39±0.18）（ t=3.638， P=0.007）；MMP-13的表达量（0.73±0.31）显著高于对照组（0.24±0.10）（ t=3.364， P=0.010）；糖原蛋白-1表达量（0.68±0.30）显著高于对照组（0.29±0.17）（ t=2.529， P=0.035）；胱天蛋白酶-3表达量（0.19±0.08）显著高于对照组（0.05±0.02）（ t=3.796， P=0.005）。 结论:大鼠发生TMJOA时，髁突软骨细胞自噬水平下降、糖原累积增多，软骨细胞凋亡率增高、数量减少，最终髁突软骨组织出现退变。

目的:观察组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)-核转录因E2相关因子2(Nrf2)信号通路对大鼠颞下颌关节(TMJ)骨关节炎(OA)髁突软骨细胞脂肪化的影响.方法:60只6周龄雌性SD大鼠随机分为10组(n=6),分别为对照组,单侧前牙反(UAC)刺激组,UAC伴HDAC3抑制剂RGFP966注射组(UAC+RGFP966组)以及UAC伴Nrf2激动剂Bardoxolone注射组(UAC+Bardoxolone组),分别于实验开始后4、8、12周处死动物,取TMJ髁突软骨进行HDAC3、Nrf2和软骨细胞脂肪化标志分子脂联素(Adiponectin)免疫组织化学染色.结果:相比于同期对照组,UAC组大鼠TMJ髁突软骨退变明显,HDAC3、Adi-ponectin阳性细胞率均显著增加(P＜0.05),而Nrf2阳性细胞率显著减少(P＜0.05);与同期UAC组相比,注射RGFP966和Bardoxolone药物后,大鼠TMJ髁突软骨中HDAC3、Adiponectin阳性细胞率显著减少(P＜0.05),Nrf2阳性细胞率显著增多(P＜0.05),软骨退变程度显著减轻.结论:UAC刺激通过HDAC3-Nrf2信号通路促进TMJ OA髁突软骨细胞脂肪化,局部药物注射干预HDAC3-Nrf2信号可抑制TMJ OA髁突软骨细胞脂肪化及软骨退变.

下颌骨的发育来源及发育过程均与全身其他骨骼有着显著差异,其发育异常会导致各种骨相关疾病,严重影响了患者的生活质量.近年来Hedgehog信号通路在骨骼发育过程中的作用越来越受到关注.Hedgehog基因包括Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)3种亚型,其中Shh及Ihh可通过多种途径参与骨代谢调节,Shh主要参与肢体发育过程,而Ihh主要是在软骨内成骨过程中发挥关键作用.Hedgehog信号通路包括Hedgehog信号蛋白配体、Patched(Ptch)受体、Smoothed(Smo)受体、核内转录因子神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homologue,Gli)和下游靶基因等.典型Hedgehog信号通路由Gli激活调控,而非典型Hedgehog信号主要由Ptch、Smo等调控.Shh在早期脊椎动物胚胎形成过程中调控多种生物学行为,如器官的分化、神经干的形成、干细胞的分化增殖、四肢骨骼发育以及牙胚发育等;在骨细胞分化过程中,Shh、Ptch1和Gli1在成骨细胞中均有表达,进一步促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞和软骨细胞分化.Ihh对骨骼生长发育以及稳态维持具有不可或缺的功能作用,参与膜内骨领的形成、软骨细胞的增殖和成熟,Ihh在成熟的颅骨成骨细胞中表达,其可作为促成骨因子调控Ptch和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)的表达来诱导膜内骨化过程;脑和肌肉ARNT样蛋白1(brain and muscle ARNT-like 1,BMAL1)可通过与Ptch1和Ihh结合,调节Hedgehog信号通路,在颞下颌关节的软骨形成和软骨内成骨过程中发挥关键作用;而Hedgehog信号激活剂可以改善由BMAL1缺失引起的下颌骨骨量减少.Hedge-hog信号失调会对骨发育过程产生重大影响,并导致一系列骨疾病如骨发育异常、骨折、骨质疏松和骨关节炎.然而,Hedgehog信号通路与下颌骨疾病的相关作用机制尚未完全阐明,未来研究可进一步探讨Hedgehog信号作为治疗下颌骨发育相关疾病的潜在靶点.

目的 观察低强度脉冲超声波对白介素-1β制造的大鼠髁突软骨细胞炎症模型中MAPK信号通路相关因子磷酸化的表达变化.方法 二次酶消化法分离髁突软骨细胞并完成鉴定.将分离出的大鼠髁突软骨细胞随机分为3组,加入3种不同浓度的IL-1β处理并进行Ⅱ型胶原与MMP-13免疫细胞化学染色,筛选出最佳致炎浓度.再次将所提取的大鼠髁突软骨细胞随机分为3组:NC组、OA组、LIPUS组,处理后对Ⅱ型胶原、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2进行免疫细胞化学染色,观察蛋白表达情况.结果 (1)成功提取大鼠髁突软骨细胞.(2)IL-1β:10 ng/mL组Ⅱ型胶原表达量降低最明显,差异有统计学意义(P＜0.05),MMP-13表达量升高最明显,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)OA组与LIPUS组Ⅱ型胶原表达量均降低,差异有统计学意义(P＜0.05),OA组降低更明显,差异有统计学意义(P＜0.05).3组的p38、ERK1/2表达量无明显差异(P＞0.05).OA组与LIPUS组p-p38、p-ERK1/2表达量均升高,差异有统计学意义(P＜0.05),OA组升高更明显,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 (1)二次酶消化法成功提取大鼠髁突软骨细胞.(2)10 ng/mL为IL-1β最佳致炎浓度.(3)LIPUS处理可减少炎性髁突软骨细胞中Ⅱ型胶原的降解,抑制了 MAPK通路相关因子p38、ERK1/2的磷酸化.

目的 通过对碘乙酸钠(monosodium iodoacetate,MIA)刺激的大鼠颞下颌关节骨关节炎的病理表现及结构变化的研究,寻找可诱发大鼠颞下颌关节骨关节炎的适宜药物浓度及作用时间.方法 选取6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠24只,随机分为4组.1组关节内注射0.9％的生理盐水,为空白组.其余3组按照0.5 mg,1.0 mg,2.0 mg三种不同浓度MIA进行颞下颌关节上腔注射,单个关节腔注射体积为50 μL.观察4周后,处死大鼠,取颞下颌关节髁突进行分析.采用苏木精-伊红(HE)染色,番红O-固绿染色,TRAP染色,CD31免疫荧光染色及显微CT(micro computed tomography,MicroCT)扫描髁突.染色标本用改良Mankin评分法评估颞下颌关节骨组织的病理改变.结果 HE和番红O-固绿染色结果显示,注射MIA1.0mg/50uL,2.0 mg/50uL组髁突软骨厚度减少,软骨细胞层数减少,排列紊乱,骨髓腔变大.0.5 mg/50uL组,未见明显变化;CD31免疫荧光染色显示1.0 mg/50 uL,2.0 mg/50 uL组可见软骨和软骨下骨连接处有新生血管,TRAP染色三组均未见破骨细胞活化.MicroCT髁突扫描显示仅2.0 mg/50 uL组可见髁突骨皮质及骨松质的破坏影像.结论 1.0 mg/50 uL是MIA诱导大鼠TMJ典型OA样病变开始出现病理学改变的最小有效剂量,可以作为早期颞下颌关节器质性病变的预防性治疗的动物模型.2.0 mg/50 uL或更高浓度的药物注射可能会得到影像学中典型的OA样改变,可以用于长期观察以及OA治疗的动物模型.

目的 运用网络药理学与分子对接方法探讨高山金莲花素(alpinumisoflavone,AIF)对颞下颌关节骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA)细胞模型的作用机制,为AIF治疗TMJOA提供研究基础.方法 运用GeneCards、OMIM、DisGeNET和PharmGKB数据库获取TMJOA疾病靶点,PharmMapper和HERB获取AIF作用靶点,取化合物与疾病交集靶点上传至STRING数据库得到关键靶点后做GO和KEGG富集分析,分子对接评估相关信号通路中关键靶点.获得医院伦理委员会的审批,提取3周龄SD大鼠髁突软骨细胞.CCK8检测AIF对髁突软骨细胞的毒性.用10 ng/mL白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)诱导髁突软骨细胞24 h构建TMJOA细胞模型.实验分为3组,其中,对照组:DMEM培养基培养髁突软骨细胞48 h;IL-1β组(TMJOA细胞模型):预使用DMEM培养基培养髁突软骨细胞24 h后,保留原培养基的情况下加入IL-1β使终浓度达10 ng/mL继续培养24 h;IL-1β+10 μmol/L AIF组:预使用含10 μmol/L AIF的DMEM培养基培养髁突软骨细胞24 h,保留原培养基情况下加入IL-1β使终浓度达10 ng/mL继续培养24 h,流式细胞术检测AIF对TM-JOA细胞模型中的髁突软骨细胞凋亡的影响.进一步,实验分为对照组、IL-1β组、IL-1β+10 μmol/L AIF组和IL-1β+30 μmol/L AIF组共4组,其中,IL-1β+30 μmol/L AIF组:预使用含30 μmol/L AIF的DMEM培养基培养24 h,保留原培养基情况下加入IL-1β使终浓度达10 ng/mL继续培养24 h;其余3组方法同前.以qPCR与Western blot分别检测AIF对TMJOA细胞模型中与细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤2(B-cell leukemia/lymphoma-2,Bcl2)、天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific protease 3,Caspase-3)及基质降解相关的解聚蛋白样金属蛋白酶4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS4)、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3)和基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)mRNA和蛋白的表达.结果 PharmMapper与HERB数据库检索得到AIF化合物靶点300个,GeneCards、OMIM、DisGeNET和PharmGKB数据库检索得到TMJOA疾病靶点378个,将化合物与疾病靶点交集得33个潜在靶点,将其上传至STRING数据库得31个关键靶点,主要与细胞凋亡和细胞外基质降解相关.这一过程可能涉及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、雌激素及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等信号通路.分子对接结果表明AIF与MAPK和雌激素信号通路中的关键靶点细胞外信号调节激酶1/2(extracellular sig-nal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)和雌激素受体基因1/2(estrogen receptor gene 1/2,ESR1/2)具有较好的结合活性.CCK8结果表明AIF对髁突软骨细胞无明显细胞毒性.与IL-1β组相比,IL-1β+10 μmol/L AIF组中AIF可抑制髁突软骨细胞凋亡;与IL-1β组相比,IL-1β+10 μmol/L AIF组和IL-1β+30 μmol/L AIF组中AIF可上调Bcl2和下调Caspase-3 mRNA和蛋白表达,抑制ADAMTS4、MMP3和MMP13 mRNA和蛋白表达.结论 AIF可通过上调Bcl2与下调Caspase-3 mRNA和蛋白表达抑制TMJOA细胞模型中髁突软骨细胞凋亡,同时抑制由IL-1β诱导的细胞外基质降解,延缓TMJOA进展.

目的:考察30 kPa流体静压力调控髁突软骨细胞增殖及凋亡的分子机制.方法:体外培养大鼠髁突软骨细胞,分为4组:正常压力组、30 kPa压力组、KN93对照组、30 kPa压力+KN93组.5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2-deoxyuridine,EdU)标记法测定细胞增殖.流式细胞术法检测细胞凋亡比例.荧光探针法检测细胞内 Ca2+水平.Western blot 法检测细胞钙调蛋白依赖性蛋白激酶 Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMK Ⅱ)、p-c-Jun、c-Jun、磷酸化的细胞外信号调节激酶 1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated ki-nase 1/2,p-ERK1/2)、细胞外信号调节激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、p-p38、p38 蛋白表达.结果:与正常压力组相比,30 kPa压力组细胞增殖率均降低;凋亡率均提高;细胞内Ca2+水平升高;CaMKⅡ蛋白表达上调,(p-c-Jun)/(c-Jun)、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)、(p-p38)/(p38)的比值均增加,差异具有统计学意义(P＜0.01).与30 kPa压力组相比,30 kPa压力+KN93组细胞增殖率均提高;凋亡率均降低;细胞内Ca2+水平降低;CaMK Ⅱ蛋白表达下调,(p-c-Jun)/(c-Jun)、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)、(p-p38)/(p38)的比值均降低,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:30 kPa静压力持续作用髁突软骨细胞,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,提高细胞内Ca2+水平,其作用机制为Ca2+通过CaMK Ⅱ激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号通路.

目的 使用数学模型模拟大鼠髁突颈骨折愈合过程中成骨与成软骨的动态变化过程,探索髁突颈骨折的愈合模式.方法 构建模拟大鼠髁突颈骨折愈合的数学模型,并统计该数学模型28 d内不同时间点生成的各参数(mb,me,cb和cc)的数值,进而拟合骨、软骨、成骨细胞及成软骨细胞的密度云图和生长曲线并推算成骨方式.结果 数学模型模拟的骨面积比与大鼠骨折实验所测接近(P＞0.05).数学模型模拟的密度云图显示,在骨折后第3天至第7天成骨集中在骨膜周围,在第7天至第21天成骨集中在软骨所在区域并逐渐替代软骨.骨生长曲线与软骨生长曲线在骨折后第5至第8天与第21至第28天正相关,与第8至第14天呈负相关.成骨细胞生长曲线和成软骨细胞生长曲线均呈现先升后降的趋势,成软骨细胞在第6天达到最大密度,成骨细胞则在第13天达到最大密度.结论 数学模型能有效模拟大鼠髁突颈骨折愈合过程,可动态展示该过程中成骨与成软骨的动态变化,为研究髁突颈骨折的愈合方法提供了新思路.

目的:以单细胞分辨率解析髁突软骨及骨髓的细胞组成与功能,及其在异常咬合应力下导致的颞下颌关节骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA)中的变化.方法:构建大鼠单侧反(胎)(unilateral anterior cross-bite,UAC)诱导的TMJOA模型.分离提取正常与UAC大鼠髁突软骨与骨髓细胞,进行单细胞转录组测序.通过质控、降维、分群、标志物分析,区分髁突细胞亚群组成.通过差异表达基因功能富集分析,明确细胞亚群功能变化.通过拟时序分析,探索细胞功能分化轨迹.通过细胞通讯预测,分析细胞间相互作用变化.结果:大鼠髁突的软骨细胞与骨髓免疫细胞分为9个亚群,在UAC中,软骨细胞减少、骨髓免疫细胞增加.髁突软骨细胞由6个功能群组成,其中具有前体细胞特征的D、F功能群可向其他细胞群分化.UAC中,软骨细胞外基质分泌功能下降、衰老与炎症通路激活、细胞间相互作用下降;骨髓中,中性粒细胞趋化、脱颗粒功能上调,单核-巨噬细胞吞噬功能激活,活化B细胞增加.结论:髁突软骨中存在不同软骨细胞亚群,异常咬合导致其数量变化、功能失调,同时引起骨髓免疫细胞功能激活.