目的:研究麻疹病毒(measles virus，MV)沪191株载体中，外源基因插入位置对基因表达及病毒复制的影响。方法:将新型冠状病毒S1蛋白表达序列克隆至MV反基因组不同基因间隔区(N基因前、P和M基因之间、H和L基因之间)，与分别表达T7聚合酶及N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞，转染后细胞裂解上清感染Vero细胞，以获得重组病毒。通过RT-PCR、免疫荧光法、Western blot和ELISA检测S1蛋白，并对重组病毒的增殖特性进行检测。结果:S1克隆至MV N基因前转染未得到重组病毒，克隆至P和M基因之间、H和L基因之间成功获得了重组病毒MV-M-S1、MV-L-S1，并可检测到S1蛋白的表达。MV-M-S1的S1表达量高于MV-L-S1，但病毒滴度低于MV-L-S1。结论:将外源基因插入MV基因组中不同位置，对基因表达及病毒复制将产生不同影响，为后续MV载体的改造提供了经验和参考。

目的 建立检测重组麻疹病毒载体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom corona-virus 2,SARS-CoV-2)疫苗病毒滴度的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用.方法 以重组质粒pUC57-S351为模板,扩增SARS-CoV-2 S基因,优化引物浓度,建立qPCR检测方法.对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限.应用建立的qPCR法对生物反应器连续培养感染后1～12d的重组病毒S基因拷贝数进行检测.结果 选择引物浓度为0.20 μmol/L建立qPCR方法.该方法能特异性检测SARS-CoV-2 S基因拷贝数;模板浓度在2 × 102～2 × 108copies/μL之间,线性关系良好(R2=0.995),检测下限为2 × 102copies/μL;6次重复检测重组病毒S基因拷贝数的变异系数(coefficient of variation,CV)为2.64％.应用建立的qPCR法检测生物反应器连续培养感染后1～12d的重组病毒S基因拷贝数的结果与细胞病变法检测结果基本一致.结论 建立的qPCR法专属性和重复性良好,可用于重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度检测.

病毒感染是一类严重危害人体健康的传染性疾病,研制疫苗防治该类疾病是当前研究的热点领域之一.麻疹病毒减毒株是一种新型疫苗载体,它可以表达多种病毒蛋白.这些病毒包括腮腺炎病毒、重症急性呼吸综合征冠状病毒、呼吸道合胞病毒、Nipah 病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒、HIV、猴免疫缺陷病毒、HBV、HCV、水疱性口炎病毒和EB病毒等.此文就麻疹病毒减毒株作为疫苗载体方面的研制现状进行综述.

以麻疹病毒沪-191疫苗株(MVs191)为载体构建表达2型登革病毒非结构蛋白NS1 (DENV2 NS1)的重组麻疹病毒.将编码DENV2 NS1 6×His蛋白的核酸序列用BsiWI和BssHII酶切位点插入至载体pT7-MVF23ATU上,然后构建载体pT7F123 DENV2 NS1 6×His,最后构建获得插入了外源基因DENV2 NS1 6×His的载体pT7MVs191-DENV2 NS1 6×His.质粒pT7MVs191-DENV2 NS1 6×His与表达麻疹病毒N、P、L蛋白的辅助质粒共转染BSRT7细胞完成病毒包装后,在Vero细胞内增殖,完成重组病毒的拯救.重组病毒在Vero细胞上传至第4代,基因测序证明重组病毒中成功插入了外源基因DENV2 NS1 6×His;Western Blot、原位免疫荧光反应可检测到重组病毒中麻疹病毒N蛋白及外源抗原DENV2 NS1 6×His的表达;重组病毒增值特性与疫苗株MVs191相似;P1至P4代的重组病毒滴度稳定在6log10 CCID50/mL～6.5log10 CCID50/mL之间;P4代重组病毒免疫家兔,兔抗血清中麻疹病毒中和抗体效价大于1∶160;Western Blot可检测到免疫兔血清中DENV2 NS1的抗体.本文成功构建了以麻疹病毒为载体,表达外源抗原DENV2 NS1的重组病毒,为以麻疹病毒为载体的登革疫苗研发奠定基础.

肿瘤是人类死亡的首位病因,研制疫苗防治肿瘤是当前研究的热点领域之一.麻疹病毒的减毒株是一种新型疫苗载体,它可以表达多种肿瘤蛋白,这些肿瘤包括多形性胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肝胚细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌和乳腺癌等.

新培斯病毒引起的新培斯热是一种自然疫原性疾病.该病毒可诱导感染的宿主产生细胞、体液和黏膜免疫应答,通过分子生物学技术可改造为理想的疫苗载体,从而表达病毒、寄生虫和细菌等病原体的多种蛋白抗原.这些病原体包括汉城病毒、拉克罗斯病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、风疹病毒、狂犬病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、日本脑炎病毒、传染性胃肠炎病毒、单纯疱疹病毒1型、刚地弓形虫、约氏疟原虫、埃及伊蚊、结核分枝杆菌和炭疽杆菌等.本文简要综述新培斯病毒介导的病原体疫苗研制现状.

委内瑞拉马脑炎病毒引起的委内瑞拉马脑炎是一种自然疫原性疾病.该病毒可诱导感染的宿主产生细胞、体液和粘膜免疫应答,可通过分子生物学技术改造为理想的疫苗载体,从而表达病毒和细菌的多种蛋白.这些病原体包括Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、流行性感冒病毒、人乳头瘤病毒16型、Norwalk样病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、麻疹病毒、炭疽杆菌和金黄色葡萄球菌等,本文综述委内瑞拉马脑炎病毒介导的病原体疫苗的研制现状.

溶瘤病毒(oncolytic virus,OVs)疗法是治疗肿瘤的一种新方法,它可通过直接杀死肿瘤细胞并引起机体的免疫反应发挥作用.然而天然溶瘤病毒有一定的局限性,因此需将各种不同的病毒作为载体,通过基因修饰的方法增强或减弱病毒毒力并导入新的功能性基因,以提高其溶瘤作用.目前可以作为溶瘤病毒载体的有单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒等.这些病毒载体均可通过不同的基因修饰方法,靶向性感染并杀死不同的肿瘤细胞,获得较好的溶瘤作用.本文综述了几种溶瘤病毒载体的基因修饰方法,以及修饰后的溶瘤效果.

麻疹病毒是一种传染性很强的病毒,是麻疹的病原体.我国自20世纪60年代初应用减毒活疫苗以来,儿童麻疹发病率显著下降.在天花灭绝后,WHO已将麻疹列为计划消灭的传染病之一.随着分子生物学的进展,各种减毒活疫苗和其他微生物载体的麻疹病毒疫苗也相继问世.同时,几十年来麻疹病毒减毒活疫苗的运用表明了其安全、高效,目前也被广泛用作重组麻疹病毒(rMV)载体平台,并已被应用于预防病毒感染,溶瘤等医学研究领域.现对rMV的功能和应用等方面的研究进展作一综述,为深入研究重组麻疹病毒的溶瘤机制和进一步完善重组麻疹病毒载体平台提供参考.

目的 建立麻疹疫苗株Schwarz(MVSW)反向遗传系统.方法 将MVSW全长cDNA分为F1 ～ F7共7个片段,在F1片段的5'端插入T7启动子及锤头核酸酶序列(hammerhead ribozyme,HamRz),F7片段的3'端插入T7终止子及丁型肝炎病毒核酶序列(hepatitis D virus ribozyme,HdvRz),分别将F1 ～ F7片段克隆至pT7-MCS2载体上,7个重组质粒经酶切按顺序拼接MVSW全长cDNA,获得全长质粒pT7MVSW.同时构建表达MVSW核蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)的3个辅助质粒.将全长质粒与3个辅助质粒及表达T7RNA聚合酶的质粒(pT7-T7R NAP及pCDIBP-T7RNAP)共同电转染Vero细胞,拯救获得病毒rMVSWO收获的rMVSW在Vero及CEC细胞中进行传代培养,观察细胞病变、检测病毒滴度并进行病毒测序,同时免疫小鼠检测抗rMVSW中和抗体.结果 经酶切鉴定,全长质粒及辅助质粒均构建正确.拯救病毒rMVSW在Vero及CEC细胞培养的病变典型特征类似;P2代病毒rMVSW扩增片段与疫苗株MVSW理论序列一致;rMVSW经Vero细胞连续培养P2～ P10代病毒滴度稳定在5.5～6.5 lgCCID50/mL之间;rMVSW及疫苗株MVS191诱导的抗rMVSW抗体滴度接近.结论 成功建立了麻疹疫苗株MVSW的反向遗传系统,获得的具有良好遗传稳定性及免疫原性的拯救病毒rMVSW有作为疫苗生产用毒种的潜力.