2021年，美国危重病医学会及欧洲危重病协会联合发布了《拯救脓毒症运动：2020国际脓毒症和感染性休克管理指南》，提出93条推荐意见。同年，日本集中治疗医学会及日本急救医学会也联合发表了《日本脓毒症诊疗指南2020》，涵盖22个领域的118个临床问题。本文将两个指南的内容按照国际指南的顺序，从筛查、初始复苏、平均动脉压、转入重症监护病房（ICU）、感染诊断、抗菌药物给药时机、启动抗菌治疗的生物标志物、抗菌药物的选择、抗真菌治疗、抗病毒治疗、抗菌药物的输注、药代动力学和药效学、感染源控制、抗菌药物降级策略、抗菌药物使用疗程、停用抗菌药物的生物标志物、液体管理、血管活性药物、正性肌力药、监测和静脉通路、液体平衡、氧合目标、经鼻高流量氧疗、无创通气、保护性通气在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中的应用、非ARDS呼吸衰竭患者的小潮气量、肺复张、俯卧位通气、肌松剂、体外膜肺氧合（ECMO）、糖皮质激素、血液净化、红细胞（RBC）输注、免疫球蛋白、应激性溃疡的预防、静脉血栓栓塞（VTE）的预防、肾脏替代治疗、血糖管理、维生素C、碳酸氢钠治疗、营养、治疗目标、姑息治疗、同伴支持团体、治疗的交接、寻求经济或社会支持、脓毒症患者以及家属的脓毒症知识教育、共同决策、出院计划、认知疗法、出院后随访等50个条款进行比较，便于大家了解脓毒症和感染性休克领域一些观点的碰撞，加深认识。

目的:拯救肠道病毒A组71型(enterovirus group A type 71, EV-A71)VP1蛋白突变型毒株(Val147→Ala)，探究该位点对病毒毒力的影响。方法:以SDLY107构建的质粒pMD19-T-EGFP-107为模板，利用定点突变和反向遗传学技术构建重组质粒pMD19-T-EGFP-107(VP1-1)，重组质粒转染至BSR-T7/5细胞，转染产物在RD细胞中连续传代3次，成功拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)，qRT-PCR检测病毒复制力，细胞增殖(CCK-8)和乳酸脱氢酶(LDH)实验检测病毒致细胞损伤力。结果:重叠融合PCR扩增得到目的片段，大小约3.4 kb；重组质粒经双酶切鉴定，测序验证突变成功。重组质粒转染BSR-T7/5细胞24 h观察到明显荧光，所收培养物上清接种至RD细胞24 h观察到明显荧光。qRT-PCR检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)在RD细胞中的复制能力弱于强毒株SDLY107( t＝9.58， P<0.001)。CCK-8、LDH实验检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)在RD细胞( t＝106.60， P<0.001； t＝39.88， P<0.001)、SH-SY5Y细胞( t＝18.72， P<0.001； t＝19.09， P<0.001)中的致细胞损伤力均明显弱于强毒株SDLY107。 结论:成功拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)，证实VP1蛋白第147位氨基酸位点突变可降低病毒的复制力及其致细胞损伤力，为进一步研究VP1蛋白在EV-A71致病机制中的作用提供基础。

急性呼吸道病毒感染给世界各地的儿童造成了巨大的疾病负担，早期、快速、准确的病毒病原诊断对于选择适当的治疗、拯救生命、阻止暴发流行及避免不必要的抗生素使用具有重要意义。面对日益增多且多样化的实验室诊断方法，需要正确分析儿童急性呼吸道感染病毒病原检测结果。现对目前在用或即将应用于临床的诊断方法进行概述，并对临床报告的正确解读加以详细阐述，以便为临床医师更好地分析呼吸道病毒病原结果提供帮助。

目的:构造乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)/寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)嵌合株JEV/ZIKV包膜蛋白D393E突变的病毒感染性克隆并进行突变株的拯救，探讨D393E突变对病毒小鼠脑内神经毒力的影响情况。方法:利用分子克隆和重叠延伸PCR技术构造含D393E突变的嵌合病毒质粒，并用线性化处理后的质粒片段进行转录，取得病毒RNA，电转染入细胞，获得突变株。用突变病毒、源病毒分别感染细胞和小鼠，对比两种病毒的复制效率、蚀斑特点以及脑内神经毒力差异。结果:酶切结果证实：突变株JEV/ZIKV (D393E)感染性克隆成功地构建。病毒蚀斑实验：JEV/ZIKV (D393E)的蚀斑直径为0.7±0.2 mm，JEV/ZIKV蚀斑直径为1.3±0.2 mm。病毒小鼠脑内毒力检测：JEV/ZIKV (D393E)的LD 50为31.51PFU，JEV/ZIKV的LD 50为2.21PFU。 结论:ZIKV D393E突变使嵌合病毒对小鼠的脑内神经毒力减弱。

目的:建立转染RNA拯救CVB3的方法，为优化CVB3的分离鉴定和体外培养提供技术参考。方法:比较Qiagen 57704、Qiagen 52904和Trizol三种核酸提取试剂提取CVB3基因组RNA的效率及Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000两种转染试剂转染病毒RNA的效率；探究提取RNA时增加洗脱次数对病毒拯救效率的影响；比较使用HeLa细胞、Vero细胞和HEK293T细胞拯救CVB3的效率。由此确定转染病毒RNA拯救CVB3的最适条件。结果:Qiagen 57704、Qiagen 52904、Tizol试剂盒提取RNA拯救病毒的噬斑数分别为13.33±1.53、150.00±15.00、1.67±0.58，三种方法提取CVB3 RNA拯救病毒RNA的效率差异具有统计学意义( F＝268.920， P<0.001)；Lipofectamine3000、Lipofectamine2000转染病毒RNA形成的噬斑数分别为74.50±3.00、22.00±5.00，差异具有统计学意义( P<0.01)；HEK293T细胞培养病毒拯救CVB3的效率高于HeLa细胞和Vero细胞，三种细胞拯救病毒的拷贝数分别为6.09×10 7±8.00×10 5、5.18×10 3±6.17×10 2、0，差异具有统计学意义( F＝17 383.644， P<0.001)，同时发现提取RNA时通过多次洗脱可以提高病毒拯救的效率。 结论:本研究成功建立了一种优化的转染RNA拯救CVB3的方法，选用Qiagen 52904核酸提取试剂盒、增加洗脱次数、使用Lipofectamine 3000转染试剂、HEK293T细胞转染等方法，可以有效提升病毒的拯救效率。

目的:构建乙脑/寨卡嵌合病毒(ChimZIKV)并评价其是否可成为寨卡候选疫苗株。方法:用基因克隆技术将寨卡病毒prM/E基因替换乙脑病毒疫苗株相应区域，构建乙脑寨卡嵌合病毒感染性克隆，体外转录制备RNA，电转染导入BHK-21细胞拯救获得ChimZIKV，通过噬斑试验、免疫荧光、基因测序鉴定病毒；检测其生长特性；通过动物实验分别检测其小鼠脑内神经毒力、病毒血症、中和抗体产生能力及免疫保护效果。结果:酶切和测序结果表明ChimZIKV感染性克隆成功构建，病毒测序及免疫荧光证实嵌合病毒拯救成功；噬斑试验显示该嵌合病毒呈小噬斑；生长曲线显示其增殖速度慢于乙脑疫苗株；细胞增殖活性试验显示该嵌合病毒感染组细胞的增殖活性明显高于乙脑病毒疫苗株感染组；动物实验结果显示嵌合病毒对小鼠和乳鼠都表现出极低的神经毒力；病毒血症结果显示该嵌合病毒在小鼠体内没有检测到明显的病毒血症；噬斑减少中和试验显示免疫小鼠血清中和抗体的阳转率达100%，第3周中和抗体效价最高(GMT＝85)；免疫保护试验显示对ChimZIKV(MR766)的脑内攻击保护率为30%。结论:嵌合病毒ChimZIKV具有一定的免疫原性和较好的安全性，有进一步发展为寨卡病毒候选疫苗株的可能。

目的:采用不同的流感病毒骨架构建表达分泌荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)的重组流感病毒，同时研究其生长特性、遗传稳定性、Gluc表达水平、体外抗流感药物活性。方法:在PR8NA的C端插入猪捷申病毒2A肽(porcine teschovirus-2A autocleavage peptide, P2A)自剪切位点及Gluc编码基因，其余7个质粒分别来源于A/Puerto Rico/8/34(PR8) (H1N1)和A/WSN/1933(WSN) (H1N1)，通过流感病毒反向遗传学8质粒系统拯救重组病毒，分别命名为PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN。检测重组病毒遗传稳定性；对比PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN的荧光强度；检测重组病毒的生长动力学；同时测定PR8NAGluc/WSN荧光强度与半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose，TCID 50)的相关性及对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟的体外抗流感药物活性。 结果:通过反向遗传学成功拯救出以PR8和WSN为骨架表达Gluc的重组病毒。相对于PR8骨架，以WSN为骨架明显提高了Gluc的表达且遗传稳定，复制动力学比野生型稍低。PR8NAGluc/WSN荧光强度与TCID 50有较好的相关性，其对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟具有良好的敏感性。 结论:以WSN为骨架的重组病毒荧光表达强度比PR8骨架高，为高通量筛选抗流感病毒药物及研发流感病毒载体疫苗提供参考。

目的:基于重组流感病毒载体的呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的构建及在小鼠体内的免疫保护效果评价。方法:构建并拯救表达RSV A2型G蛋白胞外结构域(Gecto)的重组甲型流感病毒，将其命名为PR8NAGecto/WSN。体外验证重组病毒G蛋白表达与病毒生长动力学后，单剂滴鼻免疫BALB/c小鼠，并评价体液免疫、黏膜免疫与细胞免疫。免疫4周后，分别用RSV A2与RSV B9320进行攻毒，通过小鼠体重变化、肺组织病毒滴度及病理评价免疫保护效果。结果:单剂滴鼻免疫PR8NAGecto/WSN能在小鼠体内产生较强的体液免疫、黏膜免疫及细胞免疫。与对照组比较，免疫组小鼠经RSV A2或B9320两个亚型病毒攻毒后肺病毒载量与肺组织病理均明显改善。结论:单剂滴鼻免疫重组PR8NAGecto/WSN疫苗可在小鼠体内诱导较强的RSV特异免疫应答与攻毒保护。本研究为新型RSV黏膜疫苗的研发提供新的思路与实验资料。

目的:构建并拯救增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)标记的EGFP-EV-A71重组病毒。方法:利用重叠PCR技术，以pMD19T-SDLY107全长质粒为模板，将2A蛋白酶识别序列加入到结构蛋白VP4的5′端；以pEGFP-N1质粒作为模板，扩增获得EGFP目的片段，将其插入到上述重组质粒中，得到重组质粒pMD19T-107-EGFP。经酶切和体外转录后，转染横纹肌细胞肉瘤(RD)，拯救获得重组病毒EGFP-EV-A71。采用Karber法计算细胞培养半数感染量(CCID 50)以测定病毒滴度。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同时间点的病毒复制水平，并绘制病毒复制曲线，比较重组病毒与母本病毒的复制力有无差异。乳酸脱氢酶(LDH)和细胞增殖(CCK-8)实验分别测定被感染细胞的细胞损伤率和存活率。 结果:包含EGFP的重组EV-A71感染性cDNA克隆被成功构建；转染RD细胞后，出现典型的细胞病变并且表达出较强的绿色荧光；重组病毒与母本病毒具有相似的复制动力学特征和致细胞病变效应。结论:成功拯救了EGFP标记的重组病毒EGFP-EV-A71。

目的 探究LINC00626通过JAK1/STAT3/KHSRP信号轴调控结直肠癌恶性进展及其潜在的分子机制.方法 选取2021年6月11日至2023年6月11日在河南大学淮河医院确诊为结直肠癌的患者96例为研究对象,分别取患者的癌组织和癌旁正常组织.体外培养结直肠癌细胞系(SW620、HCT116、HT29、DLD-1、LOVO、Caco-2)和结直肠正常细胞(NCM460),qRT-PCR检测结直肠癌组织和细胞系中LINC00626、KHSRP的表达情况.筛选出慢病毒感染细胞系,SW620和HCT116细胞系分别转染敲降慢病毒及其对照,HT29和DLD-1细胞系分别转染过表达慢病毒及其对照.选取稳定转染的细胞系进行细胞功能实验,检测增殖、迁移、侵袭能力.小鼠活体动物实验检测LINC00626对结直肠癌肿瘤生长和迁移的影响.Western blot法检测稳染细胞中KHSRP蛋白的表达水平.拯救实验研究LINC00626与KHSRP的调控关系.结果 qRT-PCR显示,在结直肠癌组织和细胞系中LINC00626低表达,而KHSRP高表达.细胞功能实验显示,与sh-NC组相比,sh-LINC00626组在SW620和HCT116细胞促进细胞增殖、细胞迁移、侵袭,过表达组则反之.细胞拯救实验显示,LINC00626+KHSRP可显著逆转敲降LINC00626对细胞增殖、细胞迁移、侵袭的促进作用.裸鼠实验中,与sh-NC组相比,sh-LINC00626组裸鼠肿瘤体积和重量、细胞增殖率和结直肠癌肺转移病灶数目明显增加;过表达结果相反.信号通路实验显示,与sh-NC组相比,sh-LINC00626组JAK1、STAT3mRNA的表达量显著上调,过表达组结果相反.结论 LINC00626通过JAK1/STAT3/KHSRP信号轴,抑制结直肠癌转移的恶性进程.