目的:分析3个复合杂合变异所致的遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系的基因变异类型及其临床特征。方法:选取2021年12月至2022年10月就诊于温州医科大学附属第一医院的3个家系为研究对象。检测3例先证者及其家系成员的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和FⅦ活性(FⅦ：C)。用PCR法扩增先证者 F7基因所有的外显子及其侧翼序列，通过直接测序进行变异分析，并用反向测序进行验证，同时分析家系成员相应的变异位点。用ClustalX-2.1-win软件分析变异位点的保守性；用Varcards和Spcards在线软件预测变异位点的致病性；用Pymol软件分析变异前后蛋白质空间结构及分子作用力的变化。 结果:3例先证者的PT均明显延长，APTT在正常范围，FⅦ：C显著下降。基因分析共发现4种 F7基因变异，3例先证者均携带复合杂合变异。先证者1携带p.Cys389Gly和p.His408Gln复合杂合变异；先证者2携带p.Cys389Gly和IVS6＋1G>T复合杂合变异；先证者3携带IVS6＋1G>T和IVS1a＋5G>A复合杂合变异。保守性分析显示p.Cys389和p.His408位点在同源物种间均呈高度保守；Varcards和Spcards软件分析显示上述变异位点均为致病性；蛋白模型分析显示p.Cys389Gly和p.His408Gln变异会分别导致蛋白质空间结构改变和氢键发生变化。 结论:3个FⅦ缺陷症先证者的FⅦ水平降低可能分别与p.Cys389Gly和p.His408Gln复合杂合变异、p.Cys389Gly和IVS6＋1G>T复合杂合变异及IVS6＋1G>T和IVS1a＋5G>A复合杂合变异有关，这3种复合杂合变异的组合既往均未见报道。

目的:对2例罕见超数小标记染色体(sSMC)患者进行细胞分子水平的遗传学分析，为携带者夫妇的遗传咨询和生育指导提供借鉴。方法:选取2018年10月31日和2021年5月10日于中信湘雅生殖与遗传专科医院进行生殖与遗传咨询的不孕不育患者2例为研究对象。应用常规G显带、荧光原位杂交(FISH)和基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)确定sSMC的来源，应用显微切割结合高通量全基因组测序(MicroSeq)精准分析sSMC的常染色质片段大小和基因组信息。结果:患者1的G显带和FISH结果提示其核型为mos 47，XY，del(16)(p10p12)，＋mar[65]/46，XY，del(16)(p10p12)[6]/ 48，XY，del(16)(p10p12)，＋2mar[3].ish mar(Tel 16p-，Tel 16q-，CEP 16-，WCP 16＋)，基因组CNV-seq结果为arr[GRCh37]16p12.1p11.2(24999364_33597595)×1[0.25]，MicroSeq结果显示该sSMC来源于16p12.1p11.2(24979733-34023115 bp)。患者2的G显带和反向FISH结果提示其核型为mos 47，XX，＋mar[37]/46，XX[23].rev ish CEN5，基因组CNV-seq结果为seq[GRCh37] dup(5)(p12q11.2)chr5：g(45120001_56000000)dup[0.8]，MicroSeq结果显示该sSMC来源于5p12-q11.2(45132364-55967870 bp)。2对夫妇分别接受了植入前遗传学检测(PGT)和体外受精(IVF)助孕治疗。结论:sSMC携带者的个性化分析对其后期的遗传咨询和生育指导具有重要意义，对于存在高遗传风险的sSMC携带者夫妇可考虑选择MicroSeq-PGT助孕。

目的:运用双样本双向孟德尔随机化法，探讨人免疫细胞与增生性瘢痕（HS）之间的因果关系。方法:该研究基于双样本双向孟德尔随机化（MR）法，分别从全基因组关联分析catalog数据库和FinnGen数据库获取731种人免疫细胞与HS的数据集。设置显著阈值，筛选与免疫细胞及HS显著相关的单核苷酸多态性（SNP）并排除弱工具变量偏倚的影响。采用逆方差加权（IVW）法［同时采用错误发现率（FDR）中的Benjamini-Hochberg法校正其 P值］初步检测免疫细胞与HS的因果关系并筛选与HS有显著因果关系的免疫细胞。进一步地，采用双样本MR分析的5种方法：IVW法、加权中位数法、简单模式法、加权模式法和MR-Egger法绘制散布图检测筛选出的免疫细胞与HS的因果关系。针对符合假设的免疫细胞SNP，进行Cochran Q检验评估异质性，进行MR-Egger回归和MR-PRESSO法排除水平多效性，进行留一法分析来评估显著结果是否由单个SNP决定。采用双样本MR分析中IVW法反向检测HS与免疫细胞之间的因果关系。 结果:731种免疫细胞达到显著阈值的SNP数量从7个到1 786个不等，HS中达到显著阈值的SNP数量有119个，这些SNP的 F值均>10，提示具有弱工具变量偏倚的可能性较小。IVW法分析显示，60种免疫细胞与HS具有潜在因果关系（ P值均<0.05），经Benjamini-Hochberg法校正后，仅CD45RA和CD39双阳性调节性T细胞（Treg）与HS具有潜在因果关系（ PFDR<0.05）。IVW法（比值比为1.16，95%置信区间为1.08~1.24， P<0.05、 PFDR<0.05）、加权中位数法（比值比为1.16，95%置信区间为1.05~1.28， P<0.05）、加权模式法（比值比为1.14，95%置信区间为1.02~1.27， P<0.05）和MR-Egger 法（比值比为1.18，95%置信区间为1.07~1.30， P<0.05）的散布图均显示，CD45RA和CD39双阳性Treg的14个SNP与HS患病风险存在因果关系；仅简单模式法的散布图显示，CD45RA和CD39双阳性Treg的14个SNP与HS患病风险的因果关系不明显（ P>0.05）。Cochran Q检验显示，CD45RA和CD39双阳性Treg与HS的因果关系不存在异质性（ P>0.05）。MR-Egger回归、MR-PRESSO法分析显示，CD45RA和CD39双阳性Treg与HS的显著因果关系不存在水平多效性（ P>0.05）。留一法分析显示，CD45RA和CD39双阳性Treg与HS的显著因果关系在逐个剔除SNP后结果稳定。双样本反向MR分析显示，HS与731种免疫细胞均无潜在因果关系（ P>0.05）。 结论:从遗传学的角度揭示，免疫细胞CD45RA和CD39双阳性Treg可能会增加HS患病风险。

目的:应用光学基因组图谱(OGM)技术探讨1个罕见的17号染色体臂内反向插入家系的遗传学特征。方法:选取2021年10月在杭州市妇产科医院产前诊断中心就诊的1例血清学筛查高风险孕妇及其家系成员作为研究对象。用染色体G显带核型分析、荧光原位杂交(FISH)、单核苷酸多态性微阵列(SNP array)、OGM等技术对该家系的17号染色体异常进行综合分析和验证。结果:羊水染色体核型分析及SNP array检测提示胎儿染色体17q23q25区存在11 Mb重复。孕妇核型分析提示17号染色体结构异常，但SNP array检测未见异常，OGM检测提示其染色体17q23q25区存在臂内反向插入，经FISH检测确认。胎儿父亲核型未见异常。结论:胎儿的染色体17q23q25区重复衍生自其母亲17号染色体的反向插入。OGM技术对于鉴定平衡性染色体结构异常具有一定的优势。

目的:研究肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)中3D蛋白关键氨基酸突变对病毒增殖的影响，并根据3D三级结构模型推断突变影响病毒增殖能力的可能机制。方法:以强毒株SDLY107构建的质粒pMD19T-SDLY107-EGFP为模板，利用定点突变和反向遗传学技术构建病毒突变株，对突变株增殖特性进行测定。同时对3D蛋白三级结构进行预测，根据3D蛋白的结构域功能特性推测突变影响病毒增殖能力的可能机制。结果:经过双酶切鉴定和病毒基因测序证实已成功构建两株突变株病毒：EGFP-EV-A71(S37N)和EGFP-EV-A71(R142K)。两株突变株在RD细胞中的增殖速率均明显弱于亲本毒株。3D蛋白三级结构预测模型显示3D蛋白由"手指(finger)"、"拇指(thumb)"和"手掌(palm)"三个结构域构成握杯状右手结构，S37N位于"拇指"结构域，R142K位于"手指"结构域，而"拇指"和"手指"结构域对3D聚合酶的活性以及蛋白的稳定性具有重要影响。结论:S37N和R142K突变降低了EV71的复制能力，这两个突变可能是通过改变3D蛋白聚合酶活性和结构域之间的相互作用，进而影响EV71病毒增殖。

目的:通过反向遗传学方法，探索白念珠菌F1Fo-ATP合酶α亚基编码基因（ATP1）通过清除细胞内活性氧以逃逸巨噬细胞杀伤的生理作用。方法:以白念珠菌ATP1缺失株及其亲本株为研究对象，接种平板培养后计算菌落数评估其体外细胞活性，通过尾静脉接种小鼠后计算肾脏组织形成菌落数评估体内细胞活性。将培养过夜的白念珠菌菌液与巨噬细胞共培养后，接种平板，计算菌落数，测定菌的存活率，通过乳酸脱氢酶释放法测定巨噬细胞乳酸脱氢酶水平；以过氧化氢建立模拟巨噬细胞内氧化应激模型，过氧化氢作用白念珠菌后，通过计算菌落数比较各菌株细胞活性，采用DCFH-DA染色测定细胞内活性氧水平，实时荧光定量PCR检测过氧化氢酶1（CAT1）基因、超氧化物歧化酶4（SOD4）基因和超氧化物歧化酶5（SOD5）基因mRNA水平。采用双因素方差分析或Student t检验对数据进行统计学分析。 结果:在体外，亲本株组和ATP1缺失组菌落数随培养时间逐渐增多，24 h后ATP1缺失组菌落数仅为亲本株组的10%，差异有统计学意义（ F = 481.84， P < 0.001）。在小鼠体内，亲本株组肾脏组织形成菌落数随时间逐渐增多，但是ATP1缺失组逐渐减少，两组差异有统计学意义（ F = 78.27， P = 0.001）。与体内实验结果一致，体外白念珠菌菌体与巨噬细胞共培养后，ATP1缺失组白念珠菌存活率（62.67 ± 3.51）%比亲本株组（82.33 ± 2.52）%显著降低（ t = 7.88， P = 0.001），与ATP1缺失组共培养的巨噬细胞乳酸脱氢酶释放百分比（27.80 ± 3.54）%比与亲本株组共培养的巨噬细胞（87.78 ± 0.17）%显著降低（ t = 33.89， P < 0.001）。在模仿的巨噬细胞内氧化应激模型中，ATP1缺失组细胞活性比亲本株组显著降低，差异有统计学意义（ F = 3 440.65， P < 0.001）。在与巨噬细胞共培养以及模仿的巨噬细胞内氧化应激模型中，ATP1缺失组细胞内活性氧水平均比亲本株组显著增高，差异有统计学意义（均 P < 0.001）。ATP1缺失组CAT1、SOD4、SOD5 mRNA水平均比亲本株组降低，差异均有统计学意义（均 P < 0.001）。 结论:ATP1缺失可能分别通过下调氧化应激和活性氧清除相关基因表达，使白念珠菌抵抗氧化应激和清除活性氧的能力明显减弱，最终不能逃逸巨噬细胞杀灭而被宿主清除。

目的:探讨一个遗传性凝血因子XI(coagulation factor Ⅺ，FⅪ)缺陷症家系成员的分子致病机制。方法:提取外周血基因组DNA，并采用Sanger测序法检测先证者的15个外显子、侧翼序列及家系成员的相应变异外显子区域，并用反向测序予以验证；ClustalX-2.1-win软件分析变异氨基酸位点的保守性；用Mutation Taster、PolyPhen2、PROVEAN三个在线生物信息学软件分析变异的致病性；用Swiss-pdbViewer软件分析变异氨基酸对蛋白质结构的影响。结果:基因分析显示先证者第10外显子存在c.1107C>A(p.Tyr369stop)杂合无义变异以及第13外显子存在c.1562A>G(p.Tyr521Cys)杂合错义变异；其父亲携带c.1107C>A杂合无义变异，其母亲和女儿均携带c.1562A>G杂合错义变异，丈夫为野生型。保守性分析表明Tyr521在进化过程中为高度保守位点。变异碱基致病性预测发现c.1107C>A和c.1562A>G均为致病性变异。蛋白质模型分析显示在野生型FⅪ蛋白结构中，Tyr521分别与Lys572、Ile388形成一个氢键，当变异为Cys521后，原有的苯环结构消失，并且与Lys572的侧链增加了一个氢键，改变了蛋白的催化结构域；p.Tyr369stop变异形成截短蛋白，这些变化均可能使蛋白质的功能受到影响。结论:该家系第10外显子c.1107C>A杂合无义变异以及第13外显子c.1562A>G杂合错义变异是导致该家系FⅪ水平降低的主要原因。

目的:拯救肠道病毒A组71型(enterovirus group A type 71, EV-A71)VP1蛋白突变型毒株(Val147→Ala)，探究该位点对病毒毒力的影响。方法:以SDLY107构建的质粒pMD19-T-EGFP-107为模板，利用定点突变和反向遗传学技术构建重组质粒pMD19-T-EGFP-107(VP1-1)，重组质粒转染至BSR-T7/5细胞，转染产物在RD细胞中连续传代3次，成功拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)，qRT-PCR检测病毒复制力，细胞增殖(CCK-8)和乳酸脱氢酶(LDH)实验检测病毒致细胞损伤力。结果:重叠融合PCR扩增得到目的片段，大小约3.4 kb；重组质粒经双酶切鉴定，测序验证突变成功。重组质粒转染BSR-T7/5细胞24 h观察到明显荧光，所收培养物上清接种至RD细胞24 h观察到明显荧光。qRT-PCR检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)在RD细胞中的复制能力弱于强毒株SDLY107( t＝9.58， P<0.001)。CCK-8、LDH实验检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)在RD细胞( t＝106.60， P<0.001； t＝39.88， P<0.001)、SH-SY5Y细胞( t＝18.72， P<0.001； t＝19.09， P<0.001)中的致细胞损伤力均明显弱于强毒株SDLY107。 结论:成功拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)，证实VP1蛋白第147位氨基酸位点突变可降低病毒的复制力及其致细胞损伤力，为进一步研究VP1蛋白在EV-A71致病机制中的作用提供基础。

孟德尔随机化是一种以遗传变异为工具变量的因果推断法，它利用遗传变异的分配随机性和时序优先性，有效克服了传统观察性研究中的混杂偏倚和反向因果，成为近年的研究热点。牙周炎作为一种复杂的炎症性疾病，其与多种因素间存在相互关联，但这种关联认知多基于传统观察性研究，目前仍缺乏推断因果关系的有力证据。鉴于孟德尔随机化可能给牙周领域带来新的研究思路，本文针对该方法及其在牙周炎研究领域中的应用进展作一综述。

冠状病毒是有包膜的、单股正链RNA病毒，基因组长约26~32 kb。人类冠状病毒感染通常引起上呼吸道与下呼吸道疾病，严重程度从普通感冒到严重急性呼吸综合征不等。SARS-CoV-2是2019年开始在全球范围内暴发流行的冠状病毒，通过反向遗传技术对人冠状病毒cDNA进行操作，构建感染性克隆，有助于对冠状病毒基因组分与功能进行深入研究，并应用于疫苗与药物研发。因此当前SARS-CoV-2反向遗传学技术的建立与应用研究尤为重要。本文讨论了人冠状病毒反向遗传技术及应用，对SARS-CoV-2感染性克隆构建技术与应用进展进行了综述。