目的:探讨环状RNA(circRNA)ADP核糖基化因子GTP酶激活蛋白(ASAP1)调控类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞(SFs)增殖及迁移机制。方法:提取RA及关节外伤患者SFs行后续实验。分别用Lipofectamine 3000将si-NC、si-circASAP1、miR-NC、miR-144-3p mimics、pcDNA-NC、pcDNA-circASAP1、抗miR-NC与si-circASAP1、抗miR-144-3p与si-circASAP1分别转染RA-SFs(记为si-NC组、si-circASAP1组、miR-NC组、miR-144-3p组、pcDNA-NC组、pcDNA-circASAP1组、抗miR-NC+si-circASAP1组、抗miR-144-3p+si-circASAP1组)。未转染RA-SFs记为对照组(NC组)。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖；实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测circASAP1和微小核糖核酸144-3p(miR-144-3p)表达；蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达；Transwell检测细胞迁移；双荧光素酶报告基因实验检测circASAP1靶向调控miR-144-3p表达。两组间比较采用t检验；多组间比较用单因素方差分析(两组间比较用SNK- q检验)。 结果:RA患者滑膜组织及SFs中circASAP1表达高于关节外伤患者滑膜组织及SFs(滑膜组织2.46±0.28比1.00±0.12，SFs中3.16±0.15比1.00±0.11)，miR-144-3p低于关节外伤患者滑膜组织及SFs(滑膜组织0.43±0.11比1.00±0.15，SFs中0.38±0.03比1.00±0.08)，差异有统计学意义( t＝40.949、26.182， P<0.05)。si-circASAP1组RA-SFs的circASAP1、MMP-2、MMP-9表达、细胞活力和细胞迁移数均低于NC组和si-NC组(0.47±0.03比1.00±0.07、1.02±0.10，0.41±0.03比0.83±0.07、0.81±0.06，0.35±0.03比0.77±0.06、0.75±0.06，0.57±0.05比1.12±0.07、1.11±0.09，97.00±7.23比194.00±13.25、203.00±11.54)，差异有统计学意义( F＝166.272、161.234、187.111、194.126、258.352， P<0.05)。miR-144-3p组RA-SFs的miR-144-3p表达高于miR-NC组(2.09±0.15比1.00±0.09)，MMP-2、MMP-9表达、细胞活力和细胞迁移数均低于miR-NC组(0.37±0.02比0.83±0.07、0.31±0.02比0.74±0.06、0.62±0.05比1.21±0.07、115.00±7.36比197.00±12.51)，差异有统计学意义( t＝18.693、18.956、20.397、20.541、16.949， P<0.05)。抗miR-144-3p+si-circASAP1组RA-SFs中miR-144-3p表达量低于抗miR-NC+si-circASAP1组(0.49±0.05比1.00±0.07)，MMP-2、MMP-9蛋白表达、细胞活力及细胞迁移数高于抗miR-NC+si-circASAP1组(0.89±0.06比0.40±0.03、0.72±0.07比0.34±0.02、1.02±0.08比0.57±0.04、188.00±10.67比95.00±6.13)，差异有统计学意义( t＝17.786、21.913、15.659、15.194、22.673， P<0.05)。 结论:RA患者circASAP1表达增高而miR-144-3p表达降低，抑制circASAP1通过上调miR-144-3p可降低SFs增殖和迁移能力。

目的:探讨正常和内毒素耐受的人单核细胞系THP-1细胞在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激下烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD +）消化酶CD38的表达变化情况。 方法:（1）LPS刺激正常THP-1细胞：实验组THP-1细胞采用100 ng/ml LPS处理不同时间（1、3、6、9、12和24 h），对照组以磷酸盐缓冲液处理24 h。分别采用定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）与蛋白质印迹技术检测白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）mRNA及CD38 mRNA与蛋白的表达变化。（2）LPS刺激已诱导内毒素耐受的THP-1细胞：①THP-1细胞加入100 ng/ml LPS处理24 h建立内毒素耐受THP-1细胞模型，以加入磷酸盐缓冲液处理24 h的THP-1细胞作为空白组。模型组和空白组加入LPS（100 ng/ml）刺激3 h，定量PCR检测IL-6和TNF mRNA水平以确定建模是否成功。②模型组和空白组细胞分别用LPS刺激12 h，采用定量PCR检测刺激前及刺激12 h时CD38 mRNA的表达；用LPS刺激1和6 h，采用蛋白质印迹技术检测刺激前及刺激后1、6 h时CD38蛋白的表达量。采用两独立样本 t检验和重复测量的方差分析进行统计学分析。 结果:（1）LPS刺激正常THP-1细胞：实验组各LPS刺激时间点IL-6与TNF mRNA表达水平均高于对照组，实验组自LPS刺激3 h始，CD38 mRNA和蛋白水平均高于对照组（LPS刺激3 h时CD38 mRNA：2.27±0.03与1.00±0.18；CD38蛋白：1.47±0.14与1.00±0.16， P值均<0.05）。（2）LPS刺激已诱导内毒素耐受的THP-1细胞：①确定内毒素耐受THP-1细胞模型是否构建成功：模型组IL-6和TNF mRNA水平低于空白组（ P值均<0.05），提示建模成功。②内毒素耐受THP-1细胞在LPS刺激下CD38 mRNA和蛋白表达变化：与空白组相应时间点相比，模型组CD38 mRNA在LPS刺激前（14.18±1.19与1.00±0.13， t=19.007）和LPS刺激12 h（28.33±3.98与7.61±0.88， t=8.803），CD38蛋白在LPS刺激前（1.54±0.06与1.00±0.10， t=7.796）、LPS刺激1 h（1.59±0.09与1.07±0.17， t=4.721）和6 h（2.48±0.09与1.43±0.12， t=12.233）升高；模型组CD38 mRNA在LPS刺激12 h、CD38蛋白在LPS刺激6 h时分别高于同组LPS刺激前（ P值均<0.05）。 结论:正常与内毒素耐受的THP-1细胞在LPS刺激下CD38水平均升高，CD38是NAD +消化酶，间接反映免疫抑制期间单核细胞再感染时NAD +水平变化的现象，为进一步研究CD38能否作为新生儿脓毒症临床诊断生物标记物提供了实验基础。

目的 探索高糖环境下晚期糖基化终末产物(AGEs)是否通过改变肾小球系膜细胞Ros、JC-1及其凋亡相关蛋白的表达,诱导肾小球系膜细胞线粒体途径凋亡及肾小球系膜细胞的损伤.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1,使用不同浓度的AGEs分别培养0、12、24、48 h后,MTT法观察细胞增殖能力.选择AGEs最佳作用时间和浓度后,加入caspase酶抑制剂Z-VAD-fmk及活性氧(ROS)清除剂乙酰半胱氨酸(NAC)进行培养,使用细胞凋亡检测试剂盒和AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测细胞的凋亡率,JC-1染色检测线粒体膜电位(MMP)的变化,使用细胞ROX深红流式细胞仪检测细胞内总ROS水平,Western印迹检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白BAX表达,并检测caspase-9、easpase-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)活化片段(cleaved)的表达.结果 AGEs可呈时间和浓度依赖性降低肾小球系膜细胞活力,诱导细胞死亡.250 mg/L AGEs作用24h可显著增加肾小球系膜细胞凋亡率(P＜0.01),Z-VAD-fmk可显著缓解AGEs诱导的肾小球系膜细胞凋亡(P＜0.01).与对照组相比,AGEs增加细胞内活性氧水平,降低线粒体MMP,并呈时间依赖性,AGEs引起两者显著改变的作用时间分别为1h和2h(均P＜0.01).AGEs还可减少细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达(P＜0.01),增加促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达(均P＜0.01).与AGEs组相比,NAC可显著稳固线粒体膜电位(P＜0.01),增加Bcl-2表达(P＜0.01),减少BAX、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达(均P＜ 0.01).结论 AGEs通过增加细胞内ROS水平,破坏线粒体膜势能,从而诱导肾小球系膜细胞线粒体途径凋亡.

目的 研究自然杀伤(NK)细胞及其CD38阳性亚群在类风湿关节炎(RA)患者外周血、滑液、滑膜组织中的分布特征以及CD38分子对RA患者外周血和滑液淋巴细胞功能调节机制.方法 流式细胞仪检测健康人外周血和RA患者配对的外周血、膝关节滑液中NK、CD38亚群及NK细胞表面趋化因子受体(CXCR3、CCR5)、颗粒酶B、穿孔素的表达.体外培养RA患者外周血和滑液淋巴细胞,流式细胞仪测定NK细胞颗粒酶B、穿孔素的表达,ELISA法测定培养上清TNF-α、IL-6的浓度.脂质体CD38-siRNA转染RA患者外周血淋巴细胞,Western blot法检测刺激CD38和CD38-siRNA沉默对RA外周血淋巴细胞内磷酯酶C-γ1(PLC-γ1)蛋白表达水平的影响.结果 RA患者外周血中NK细胞高表达趋化因子受体CCR5和CXCR3,与正常健康人群差异有统计学意义(P＜0.05),两种趋化因子受体主要表达于CD38+ NK细胞亚群.体外培养实验,RA滑液淋巴细胞上颗粒酶B和穿孔素的表达水平均显著高于RA外周血淋巴细胞,两者间差异有统计学意义(P均＜0.05);IL-2+ IB4联合刺激组和IB4组滑液与外周血淋巴细胞培养上清中IL-6和TNF-α的分泌量高于空白对照组(P＜0.05).CD38-siRNA干扰处理RA外周血淋巴细胞后,PLC-γ1条带的灰度值低于空白对照组(P＜0.05).结论 RA患者炎症部位(滑液、滑膜)均存在NK细胞异常浸润.CD38分子参与调节NK细胞分泌和杀伤两种功能.