文库筛选技术广泛应用于生命科学研究各领域,加速了生物医药基础科研和临床实践的进展.本文对基于CRISPR-Cas9的文库类型和应用进行综述.CRISPR-Cas9文库包括敲除、活化和抑制文库.敲除文库通过Cas9/sgRNA靶向切割DNA序列,产生移码突变进行基因敲除.活化文库包括两种:一种是dCas9/sgRNA与转录活化蛋白质融合,例如dCas9-SAM,dCas9-SunTag和dCas9-VPR系统;另一种是dCas9与表观遗传修饰酶融合,例如dCas9-Tet1和dCas9-p300系统.CRISPR-Cas9抑制文库通过dCas9与表观遗传修饰蛋白质融合,抑制转录,例如dCas9-KRAB和dCas9-Dnmt3a系统.目前,CRISPR-Cas9文库广泛用于功能基因筛选、药物靶点和耐药靶点筛选、病毒靶点筛选和揭示信号通路,并在基因互作筛选及揭示顺式调节元件功能等方面初步展现其优势.CRISPR-Cas9文库优势在于其设计灵活、操作便捷、筛选高效.伴随基因编辑系统的研发,新的筛选文库靶向性和突变将更加精准,应用将更加拓展和深化.基于CRISPR-Cas9筛选文库不仅可以筛选病理和生理过程中的关键基因和非编码DNA,还可以揭示其发挥功能的分子机制,是剖析生命复杂调控网络的手术刀.

运用由CRISPR/Cas9技术延伸的两种转录激活系统Cas9-p300和dCas9-VPR分别激活生殖特化相关基因,比较它们针对生殖细胞特化基因的激活效率.实时荧光定量PCR结果表明,这两种激活系统均可激活大部分目的基因的表达.其中,Cas9-p300系统激活BLIMP1基因的效率更高,dCas9-VPR系统激活NANOS2、DAZL、SOX17基因的效率更高,两种系统在激活DDX4、TFA P2C基因时效率无显著性差异.由此,本研究通过比较Cas9-p300和dCas9-VPR转录激活系统调控生殖特化相关基因的表达,揭示了不同的转录激活系统在激活生殖特化相关基因时的不同效率,这将为利用转录激活系统研究生殖细胞分化提供理论基础,也将为研究其他发育系统中细胞命运的转变提供借鉴.

转录因子c-Myb是造血过程中重要的调节因子,然而在白血病中c-Myb常常出现异常激活.尽管己有大量关于c-myb表达调控机制的研究,但仍有很多疑问尚未解开.本研究在人类红白血病细胞系K562中,研究了位于人类6号染色体上的c-myb基因启动子区域的表观修饰对基因转录调控的影响,分别检测了K562细胞在铁血红素(Hemin)诱导分化前后c-myb启动子的的表观修饰,同时构建靶向c-myb启动子的gRNA,利用CRISP/Cas9系统携带相应的表观修饰酶类对启动子区域进行表观修饰,检测激活和抑制性表观修饰对c-myb表达的影响.结果显示,K562细胞分化后c-myb启动子的组蛋白修饰H3K27ac,H3K4mel的水平降低,同时c-myb水平降低.dCas9-p300靶向c-myb启动子可以提高该区域H3K27ac并激活c-myb基因的表达,而dCas9-DNMT3A则提高DNA甲基化水平并抑制该基因的表达.本研究显示c-myb启动子区域表观遗传学修饰和c-myb的表达水平相关,通过改变c-myb启动子的表观遗传学修饰水平可以控制c-myb的表达水平,为进一步研究白血病提供了新的突破点.

U6 启动子是CRISPR/Cas9 基因编辑系统中驱动 sgRNA转录的重要元件,该文从西洋参 gDNA中克隆得到 7 条PqU6 启动子序列,研究了这 7 个PqU6 启动子的转录激活情况.以培养 5 周的西洋参不定根为出发材料,克隆 7 条长度为1 300 bp左右的PqU6 启动子序列.利用生物信息学工具对PqU6 启动子序列特点进行分析,并构建PqU6-P驱动GUS基因的融合表达载体,通过根瘤农杆菌介导法分转化烟草叶片进行活性检测.然后对这 7 条PqU6 启动子分别从 5'端截短处理到283、287、279、289、295、289、283 bp,以GUS为报告基因构建启动子活性检测载体并转化西洋参愈伤组织和烟草叶片.结果表明,从西洋参gDNA中克隆得到的7 条PqU6 启动子序列(PqU6-1P～PqU6-7P),核酸序列长度为1 246～1 308 bp.序列对比结果显示 7 条PqU6 启动子序列和拟南芥AtU6-P启动子一样具有影响U6 启动子转录活性的必要元件USE和TATA框.GUS染色和酶活鉴定结果显示 7 条PqU6 启动子都具有转录活性,其中长度为 1 269 bp的PqU6-7P转录活性最高,是阳性对照P-35S的1.31 倍.将7 条PqU6 启动子从5'端截短处理后(PqU6-1PA～PqU6-7PA),它们在烟草叶片和西洋参愈伤组织中的转录活性并不一致.当受体材料是西洋参愈伤组织时,长度为 283 bp的PqU6-7PA启动子转录活性是AtU6-P启动子(长度为292 bp)转录活性的 1.59 倍.上述试验结果将为西洋参及人参属等药用植物的CRISPR/Cas9 基因编辑技术提供更多理想的内源U6 启动子.