目的 基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)诱导表达系统制备呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial vi-rus,RSV)口服疫苗,并对其免疫原性进行分析.方法 将构建的质粒pUC57-Pre F与pNZ8149分别经Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,酶切产物经T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒pNZ8149-Pre F,电转化至感受态L.lactis NZ3900,经乳糖培养基筛选获得非分泌型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F,以nisin A为诱导剂诱导表达,经Western blot和免疫荧光标记对其表达产物进行分析;将雌性BALB/c小鼠随机分为PBS、L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组,15只/组,每只口服500 μL,于第1、2天进行初次免疫,第16、17天进行加强免疫,第14和28天经小鼠下颌取血并分离脾脏细胞,ELSIA法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的体液和黏膜免疫应答水平,ELISpot法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的细胞免疫应答水平.结果 重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F经PCR及测序鉴定,证明构建正确;抗原蛋白Pre F特异性地表达在L.lactis NZ3900中,相对分子质量约 50 000;初次免疫后第 14 和 28天,与 PBS 和L.lactis NZ3900/pNZ8149组相比,L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组小鼠血清Pre F-特异性IgG抗体效价、肠洗液中特异性分泌型IgA抗体以及脾脏细胞中IFNγ和IL-4分泌水平均明显升高,且差异均有统计学意义(t=-30.268～-3.087,P均＜0.05).结论 基于L.lactis诱导表达系统构建的RSV 口服疫苗具有较强的免疫原性,为研发RSV黏膜疫苗提供了参考,也为开发其他病毒或细菌口服疫苗提供了新的研究策略及方法.

目的:探讨新疆出血热病毒（XHFV）糖蛋白的2个抗原优势区（GcⅠ和GcⅡ）以不同嵌合策略以及不同免疫方式诱导小鼠免疫应答的效果。方法:以在5'端加入或不加鼠白细胞介素-2（IL-2）信号肽与通用型辅助性T细胞（Th）表位为不同设计策略，将GcⅠ、GcⅡ及GcⅠ上已鉴定出来的表位（Gc 233~248、Gc 241~256和Gc 281~296）分别进行融合并构建至真核表达载体pVAX1与原核表达载体pET-28a上。采用间接免疫荧光法检测重组真核质粒的体外表达效果后进行大量提取，将重组原核质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达及纯化。通过基因免疫、蛋白免疫和DNA初免-蛋白加强免疫（联合免疫）3种方式免疫BALB/c小鼠，酶联免疫吸附测定法检测小鼠体内IgG抗体水平以及小鼠脾细胞培养上清中IL-4和干扰素-γ（IFN-γ）的含量，噻唑蓝比色法检测小鼠脾T淋巴细胞的增殖情况。 结果:双酶切及测序结果表明8种重组质粒构建成功。荧光显微镜下可见构建的重组真核质粒在体外细胞均能成功表达。3次免疫小鼠后，各实验组的小鼠血清IgG抗体水平和刺激指数均明显高于对照组（均 P<0.01）。Th2型细胞因子IL-4与Th1型细胞因子IFN-γ的质量浓度检测结果表明，联合免疫组引起的免疫应答偏向Th1型。 结论:成功构建了XHFV糖蛋白的多表位嵌合疫苗且靶抗原在小鼠体内可有效表达，各免疫组与对照组相比均激发了较强的体液免疫及细胞免疫应答，其中pVAX1-ST（GcⅠe+GcⅡ）联合重组蛋白r（GcⅠe+GcⅡ）的免疫效果最好，有望作为XHFV的新型候选疫苗。

目的:构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)和甲型流感病毒双价DNA疫苗，并在小鼠模型中评价其免疫原性。方法:将SARS-CoV-2 Beta突变株S1蛋白编码序列和甲型流感病毒Cambodia (H3N2)株HA蛋白编码序列进行密码子优化合成，采用Over-lapping PCR方法，将两个编码基因通过自裂解2A肽(self-cleaving 2A peptides)序列连接成S1-2A-HA片段，构建能同时表达S1蛋白和HA蛋白的双价DNA疫苗，命名为pVRC-S1-2A-HA，间接免疫荧光和Western blot验证S1蛋白和HA蛋白的表达。将DNA疫苗以肌肉注射加电转途径(IM＋EP)免疫BALB/c小鼠，间接ELISA、假病毒中和试验和血凝抑制试验检测小鼠体液免疫应答，IFN-γ ELISPOT、胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining，ICS)和CBA法检测小鼠细胞免疫应答。结果:双价DNA疫苗pVRC-S1-2A-HA可以同时表达S1蛋白和HA蛋白，初次免疫后能够显著诱导小鼠产生针对S1蛋白的特异性细胞免疫和针对HA蛋白的特异性IgG结合抗体；加强免疫后特异性免疫应答都显著增强，针对S1蛋白的特异性IgG结合抗体几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)提高至3 251，细胞免疫提高至1 238 SFC/10 6个细胞，针对HA蛋白的特异性IgG结合抗体GMT达到45 407。ICS法检测到疫苗加强免疫可诱导小鼠CD4 ＋和CD8 ＋T细胞产生IL-2、IFN-γ、TNF-α；CBA结果显示单针免疫后小鼠脾细胞分泌多种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ)。 结论:本研究成功构建能同时表达SARS-CoV-2 S1蛋白和甲型流感病毒H3N2亚型HA蛋白的双价DNA疫苗，该疫苗可诱导产生针对S1蛋白和HA蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫应答，具有较好的研发与应用前景。

目的 探讨儿童血管内压力增高性紫癜误诊为过敏性紫癜的原因、鉴别要点及防范措施.方法 回顾性分析 2023 年 3 月至 2024 年 3 月收治的误诊为过敏性紫癜的血管内压力增高性紫癜患儿 38 例的临床资料.结果 38 例患儿初诊时出现不同程度的双侧下肢或双足、踝部针尖大小皮疹,散在或密集分布,不高出皮肤,压之不褪色.8 例患儿皮疹亦可见于头面部、双侧上肢及躯干部.既往诊断为过敏性紫癜,予相应治疗未见明显缓解,详细询问患儿病史,观察皮疹形态及分布特点,完善实验室检查排除其他血液系统及免疫系统疾病后诊断为血管内压力增高性紫癜,予停药观察,随访24 周.38 例患儿中 27 例皮疹复发,未予药物干预自行消退.误诊时间为 2～28 周.全部病例均未出现肾脏损害.结论 血管内压力增高性紫癜临床表现不典型,无特异性检查指标,易被误诊.临床需加强病史询问、皮疹形态的鉴别诊断,及时完善相关检查,减少误诊.

目的 初步分析BC02(BCG CpG DNA combination adjuvants system 02)复合佐剂构成成分在巨噬细胞激活过程中的协同加强作用.方法 采用夹心ELISA和RT-PCR法分别检测BC02复合佐剂及其构成成分[Al(OH)3佐剂及BC01 (BCG CpG DNA compound adjuvants system 01)佐剂]对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌的TNF-α及单核细胞趋化蛋白-l(monocyte chemotactie protein 1,MCP-1)细胞因子水平和mRNA转录水平的影响.信号通路蛋白磷酸化芯片检测经BC01和BC02刺激45 min后,RAW264.7细胞中核转录因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的变化情况.结果 BC02对巨噬细胞的刺激存在剂量和时间依赖性,最佳浓度和培养时间分别为1/10人用剂量[(7.5μg/mL BC01+20 μg/mL Al(OH)3]和24 h.Al(OH)3无机盐佐剂能协同增强BC01生物佐剂对RAW264.7细胞的刺激活性,同时,TLR-9抑制剂ODN 2088与NLRP3抑制剂MCC 950单独或联合处理RAW264.7细胞,均能显著降低BC02刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α和MCP-1细胞因子的能力.信号通路蛋白磷酸化芯片结果表明,BC02复合佐剂显著上调NF-κB信号通路中NF-KB-p105/p50、NF-κB-p65及NF-κB-p 100/p52等关键蛋白分子的磷酸化水平;同时,也能显著上调MAPK信号通路中p38 MAPK、c-Jun、SPAK/JNK及EIK-1等关键蛋白分子的磷酸化水平.结论BC02复合佐剂中BC01生物佐剂与Al(OH)3无机盐佐剂成分在激活小鼠巨噬细胞参与固有免疫应答中具有协同加强作用.

目的 表达纯化新疆出血热病毒(XHFV)糖蛋白的2个结构域GcⅠ和GcⅡ,研究其免疫原性及对小鼠免疫应答的影响.方法 构建pET28a-GcⅠ和pET32a-GcⅡ原核表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21,并优化rGcⅠ和rGcⅡ蛋白的表达和纯化条件.采用蛋白质印迹法(Western Blot)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测融合蛋白的抗原性.通过蛋白免疫和核酸初免-蛋白加强免疫2种方式免疫BALB/c小鼠,将小鼠按随机数字表法分为5组:pVAX1-GcⅠ+rGcⅠ组、pVAX1-GcⅡ+rGcⅡ组、rGcⅠ组、rGcⅡ组和生理盐水组(对照组),每组7只.采用间接ELISA检测小鼠血清抗体效价,同时通过脾T淋巴细胞增殖实验和细胞因子含量测定对免疫效果进行评价.结果 纯化获得融合蛋白rGcⅠ和rGcⅡ,两者能与绵羊阳性血清反应,具有较好的抗原性.3次免疫小鼠后,各实验组小鼠血清中的IgG水平明显高于对照组(均P<0.001),血清抗体效价均达到1:12800以上,其中rGcⅡ和pVAX1-GcⅡ+rGcⅡ组脾细胞培养上清中Th2型细胞因子白细胞介素-4(IL-4)的质量浓度明显高于对照组[(79.97±7.47)ng/L比(24.29±3.81)ng/L,(61.43±9.27)ng/L比(24.29±3.81)ng/L,均P<0.01];pVAX1-GcⅡ+rGcⅡ组Th1型细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的质量浓度最高,与对照组比较差异具有统计学意义[(42.46±2.60)ng/L比(20.33±1.67)ng/L,P<0.001],并显示出明显的抗原特异性脾T淋巴细胞增殖(P<0.001).结论 纯化后的重组蛋白rGcⅠ和rGcⅡ具有较好的免疫原性,可使被免疫机体T淋巴细胞趋向于Th2效应,且pVAX1-GcⅡ联合重组蛋白GcⅡ的抗原特异性免疫效果较好,有望作为防治XHFV的候选疫苗.

目的 基于前期分析并选取的婴儿利什曼原虫PEPCK的优势表位基因,构建相应重组原核表达载体以获得重组蛋白,构建相应重组真核表达载体并验证真核载体在NIH3T3细胞中的表达,为后续动物的免疫和感染实验备下基础.方法 根据PEPCK优势表位基因序列,经PCR反应及酶切连接构建重组原核与真核表达质粒pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK并分别转染至E.coli和NIH3T3细胞中进行表达.采用SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定原核重组质粒在大肠杆菌中的表达和原核表达蛋白被镍柱纯化后的情况,采用免疫荧光实验验证真核重组质粒在细胞中的表达.结果 重组原核与真核载体的正确测序结果表明重组载体构建成功.SDS-PAGE电泳和Western Blot的结果显示,大肠杆菌中表达的原核重组蛋白以及纯化后的蛋白在48.08 kD处存在条带,转染了真核重组载体的NIH3T3细胞的免疫荧光结果呈阳性.结论 成功构建了PEPCK优势表位基因的重组原核和真核表达载体:pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK,成功表达相应的重组蛋白并纯化并验证了pVAX1-EPEPCK在NIH3T3细胞中的表达,为后续DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强免疫的动物实验备下基础.

弓形虫和人乳头瘤病毒(HPV)具有共同的免疫保护人群,选择HPV16型晚期结构蛋白1(HPV16L1)为载体,携带弓形虫多表位(RSepitope)以期提高表位免疫原性同时可实现共免疫效应.文中分别以构建的融合体RSepitope-HPV16Ll(RSepitope融合于HPV16L1"N"端)以及HPV16L1-RSepitope(RSepitope融合于HPV16L1"C"端),脂质体转染COS-7细胞后,RSepitope-HPV16Ll融合体形式可以在转染细胞中得到有效转录和翻译,分别可检测到相应的RSepitope和HPV16L1的mRNA和蛋白,但HPV16L1-RSepitope融合体形式在转染细胞中检测不到目标抗原的mRNA和蛋白.融合体采用"DNA初免-蛋白质加强免疫"的方案免疫BALB/c小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分别检测到RSepitope-HPV16Ll免疫鼠血清中显著升高的体液和细胞免疫反应(即最高水平的RSepitope特异性抗体IgG和IFN-y),且比较单独RSepitope免疫组(不与HPV16L1融合),产生的是显著升高的Thl和Th2免疫反应类型,提示HPV16L1作为表位载体的优势效应.而HPV16L1-RSepitope融合体形式体内也未能诱导有效的免疫反应.以上研究提示,HPV16L1"N"端可能是较为合适的表位融合位置,融合体表位特异性免疫学效应显著提高,研究结果为提高表位疫苗的免疫原性提供了一个合理的载体融合策略.

背景:防龋DNA疫苗价格低廉、安全有效,有望成为人类抵抗龋病的重要手段,因而学者在寻找一种能高效诱导抗体产生的免疫途径或保护疫苗效价的缓释系统及佐剂,成为近年研究的热点.目的:观察聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸水凝胶负载pVAX1-SpaP/P防龋基因疫苗的免疫效应.方法:以聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸水凝胶分别负载重组质粒pVAX1-SpaP/P与空载质粒pVAX1.随机将28只新西兰大白兔分为7组,其中4组分别为股四头肌注射、颌下腺区皮下注射、口服、鼻腔滴注负载重组质粒pVAX1-SpaP/P的水凝胶,另3组为对照组,阴性对照组1股四头肌注射负载空载质粒pVAX1的水凝胶,阴性对照组2口服负载空载质粒pVAX1的水凝胶,空白对照组股四头肌注射生理盐水,初次免疫后1周增强免疫1次,间隔2周后加强免疫第2次,共免疫3次.应用ELISA法检测免疫前后唾液与血清中IgA型抗SpaP抗体、血清中IgG型抗SpaP抗体水平;免疫结束后第3天,免疫组化SP法检测免疫部位pVAX1-SpaP/P蛋白的表达.结果 与结论:①经不同途径免疫负载重组质粒pVAX1-SpaP/P的水凝胶,免疫后2周兔血清中IgG型抗SpaP抗体与IgA型抗SpaP抗体水平开始升高,IgG型抗SpaP抗体水平在第10周达到峰值,IgA型抗SpaP抗体水平在第6周达到峰值,口服组6-12周的IgG型抗SpaP抗体水平高于其他6组(P<0.05),颌下腺组4-8周的IgA型抗SpaP抗体水平高于其他6组(P<0.05);②经不同途径免疫负载重组质粒pVAX1-SpaP/P的水凝胶,免疫后1周兔唾液中IgA型抗SpaP抗体水平开始升高,第8周达到峰值,颌下腺组1-6周的抗体水平高于其他6组(P<0.05),口服组8-12周的抗体水平高于其他6组(P<0.05);免疫后第2周兔唾液中IgG型抗SpaP抗体水平开始升高,第10周达到峰值,口服组第2,3,6周的抗体水平高于其他6组(P<0.05),股四头肌组第10周的抗体水平高于其他6组(P<0.05);③经不同途径免疫负载重组质粒pVAX1-SpaP/P的水凝胶后,免疫组化染色显示免疫部位可见pVAX1-SpaP/P蛋白阳性表达;④结果表明,聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸水凝胶负载pVAX1-SpaP/P防龋疫苗经4种途径免疫后,能诱导兔机体产生特异性抗体发生免疫效应且维持较长时间.

目的 表达卵形疟原虫柯氏亚种(Plasmodium ovale curtisi)和沃氏亚种(P.ovale wallikeri)裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1,MSP1)N端重组蛋白,并进行抗原性及免疫原性分析,以探究其作为卵形疟候选疫苗的潜力.方法 PCR扩增卵形疟原虫基因组DNA Pomsp1 N端基因.将纯化后的PocmspJ N端、PowmspJ N端分别与pET30a、pET32a载体连接,并转化至DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切验证且测序无误后,转入大肠埃希菌BL21 (DE3) pLysS中.0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后纯化蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)检测蛋白表达情况.15只BALB/c小鼠随机分为rPocMSP1 N端组、rPowMSP1 N端组和阴性对照组,每组5只,分别腹腔注射50 μg与弗氏完全佐剂混合的rPocMSP1和rPowMSP1 N端蛋白和等量的PBS,初次免疫后第21天和第42天使用弗氏不完全佐剂加强免疫,初次免疫后第0、7、28和49天采集小鼠尾静脉血,制备血清.ELISA、Western blotting检测小鼠血清中特异性IgG、分析抗体滴度及抗体亲和指数,评估纯化后的rPocMSP1和rPowMSP1 N端蛋白的免疫原性.Western blotting检测rPocMSP1和rPowMSP1 N端蛋白的交叉反应,并用蛋白芯片分析重组蛋白在卵形疟原虫感染者血清中的抗原反应性.采用GraphPad Prism 5.0软件和Microsoft Excel 2016软件进行统计学分析,组间差异比较采用成组t检验.结果 PCR扩增结果显示,Pocmsp1 N端和Powmsp1 N端片段大小均为1068 bp,与预期大小一致.PCR产物经克隆、诱导并纯化后,所获rPocMSP1和rPowMSP1 N端蛋白浓度分别为0.5 mg/ml和1.0 mg/ml.SDS-PAGE结果显示,rPocMSP1和rPowMSP1 N端的相对分子质量(Mr)分别约为46000和59000,Western blotting结果证实蛋白成功表达.免疫组小鼠血清均可特异性识别相应抗原.ELISA结果显示,在免疫后第7天检测到特异性IgG抗体,纯化的rPocMSP1 N端蛋白和rPowMSP1 N端蛋白均与IgG发生特异性反应,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(t=5.824、25.98,P＜0.01);初次免疫后第28天,rPocMSP1 N端和rPowMSP1 N端蛋白免疫组小鼠血清A450值分别为1.043±0.390和1.923±1.373;IgG抗体水平持续上升至免疫后第49天,rPocMSP1 N端和rPowMSP1 N端蛋白免疫组小鼠血清A450值分别为1.217±0.365和2.463±0.983.rPoMSP1 N端在小鼠体内中诱导了较高的抗体应答,抗体滴度为1:640000至1:1280000.ELISA结果表明,用rPoMSP1 N端蛋白免疫的小鼠均诱导出高亲和力的IgG抗体,rPocMSP1 N端和rPowMSP1 N端免疫小鼠血清抗体亲和指数分别为97.11％和75.72％.Western blotting结果显示,rPocMSP1 N端免疫组小鼠血清中IgG抗体可以识别rPowMSP1 N端蛋白,rPowMSP1 N端免疫组小鼠血清中IgG抗体可以识别rPocMSP1 N端蛋白,两者存在交叉反应.蛋白芯片分析结果显示,rPocMSP1 N端蛋白识别卵形疟原虫感染者血清的敏感性为83.33％、特异性为57.14％,rPowMSP1 N端识别感染者血清的敏感性为97.62％、特异性为54.76％.rPocMSP1 N端、rPowMSP1 N端均与卵形疟原虫感染者血清有反应,与健康人血清相比,差异具有统计学意义(t=5.896、10.42,P＜ 0.01).结论 rPoMSP 1 N端蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生体液免疫应答,与卵形疟原虫感染者血清抗体反应上具有良好的抗原性.