Background::Differential diagnosis of active tuberculosis (ATB) and latent tuberculosis infection (LTBI) has been a challenge for clinicians in high TB burden countries. The purpose of this study was to improve the accuracy of differential diagnosis of ATB and LTBI by using fluorescent immunospot (FluoroSpot) assay to detect specific Th1 cell immune responses. The novel mycobacterium tuberculosis (MTB) latency-associated antigens Rv1733c and synthetic long peptides derived from Rv1733c (Rv1733c SLP) were used based on virulence factors early secreting antigen target-6 (ESAT-6) and culture filtrate protein-10 (CFP-10). Methods::Fifty-seven ATB cases, including 20 pathogen-confirmed ATB and 37 clinically diagnosed ATB, and 36 LTBI cases, were enrolled between January and December 2017. FluoroSpot assay was used to detect the interferon γ (IFN-γ) and interleukin 2 (IL-2) secreted by the specific T cells after being stimulated with MTB virulence factors ESAT-6 and CFP-10, MTB latency-associated antigens Rv1733c and Rv1733c SLP. The receiver operating characteristic (ROC) curve was used to define the best cutoff value of latency-associated antigens in the use of differentiating ATB and LTBI. The sensitivity, specificity, predictive value, and likelihood ratio of ESAT-6 and CFP-10-FluoroSpot combined with latency-associated antigen in the differential diagnosis of ATB and LTBI were also calculated.Results::Following the stimulation with Rv1733c and Rv1733c SLP, the frequency of single IL-2-secreting T cells stimulated by Rv1733c SLP had the largest area under the ROC curve, which was 0.766. With a cutoff value of 1 (spot-forming cells [SFCs]/2.5 × 10 5 peripheral blood mononuclear cells) for frequency, the sensitivity and specificity of distinguishing ATB from LTBI were 72.2% and 73.7%, respectively. ESAT-6 and CFP-10-FluoroSpot detected the frequency and proportion of single IFN-γ-secreting T cells; the sensitivity and specificity of distinguishing ATB from LTBI were 82.5% and 66.7%, respectively. Combined with the frequency of single IL-2-secreting T cells stimulated by Rv1733c SLP on the basis of ESAT-6 and CFP-10-FluoroSpot, the sensitivity and specificity increased to 84.2% and 83.3%, respectively. Conclusion::Rv1733c SLP, combined with ESAT-6 and CFP-10, might be used as a candidate antigen for T cell-based tuberculosis diagnostic tests to differentiate ATB from LTBI.

目的:检测肺结核患者肺部结核病灶组织中结核杆菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB)分泌抗原ESAT-6的表达特点，为肺结核病理诊断提供依据。 方法:使用川北医学院附属医院病理科所储存的手术切除的肺结核组织标本作为病例标本，阴性对照为正常肺组织标本。将肺组织蜡块连续切片后，采用免疫组化(immunohistochemistry，IHC)法检测肺结核患者结核病灶组织中ESAT-6表达，并与此标本连续切片的HE染色及抗酸染色结果进行比较分析。结果:ESAT-6阳性信号主要分布在结核病灶坏死区及其周围，与抗酸染色结果相比，ESAT-6抗原阳性范围与抗酸杆菌分布有关，但分布更广泛。相关分析显示，抗酸染色与IHC平均光密度(average optical density，AOD)值呈显著正相关( r＝0.87， P<0.05)。 结论:采用IHC可以检测到肺结核病变组织中ESAT-6的表达，有可能为肺结核诊断提供依据。

为探讨疫苗候选抗原—结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）通过黏膜接种诱导的保护性免疫效应。动物实验均使用6~8周龄雌性C57BL/6小鼠。30只小鼠接受不同的免疫接种策略，采用随机数字表法分为对照组、早期分泌抗原靶蛋白-6（ESAT-6）滴鼻组、HBHA滴鼻组、BCG初免PBS对照组、BCG初免HBHA加强组，每组6只。通过检测免疫后小鼠血浆白细胞介素17A（IL-17A）等细胞因子水平；肺IL-17A mRNA相对表达量（RQ）；肺三级淋巴结构的形成，及与其形成相关的趋化因子的检测；脾Th1、Th17细胞比例比较，从而分析免疫效应。BCG初免PBS对照组和BCG初免HBHA加强组（每组各30只小鼠），用BCG滴鼻模拟感染。在感染后预设的时间点做肺组织菌落计数，以评估细菌清除效率。多组间比较采用单因素方差分析，事后分析采用 LSD检验；两组间比较采用独立样本 t检验。结果显示，免疫后的小鼠血浆细胞因子IL-17A水平和肺IL-17A mRNA相对表达量，在BCG初免HBHA加强组［（14.76±4.73）pg/mL，RQ 为（12.27±6.71）］中最高，比对照组［（5.57±2.95）pg/mL，RQ为（1.30±0.97）］明显升高（ t=4.213， P<0.001； t=5.984， P<0.001），也显著高于BCG初免PBS对照组［（6.81±2.18）pg/mL，RQ 为（1.44±1.16）］（ t=3.646 P=0.001； t=6.185 P<0.001）。脾脏Th17细胞比例，与BCG初免PBS对照组（0.38±0.38）%比较，BCG初免HBHA加强组（1.02±0.34）%显著增高（ t=-0.280， P=0.048），该组在肺部诱导形成了三级淋巴结构，并在感染的早期降低了肺细菌负荷。综上，HBHA通过黏膜递送可有效增强BCG接种后的免疫保护效应，可能是一种有潜力的候选疫苗组分。

目的:利用表达结核分枝杆菌蛋白Ag85B、ESAT-6、Rv2031c和Rv2626c的重组腺病毒(Ad-AE-R2)滴鼻黏膜免疫小鼠，探究其对哮喘小鼠气道炎症的免疫预防作用。方法:本研究为实验研究，采用单纯随机抽样方法。将18只6~8周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组：空白对照组、哮喘模型组和免疫预防组，每组6只。免疫预防组滴鼻免疫10 8 PFU Ad-AE-R2，空白对照组和哮喘模型组滴鼻等量生理盐水。小鼠免疫3周后，利用卵清蛋白诱导免疫预防组和哮喘模型组小鼠哮喘。空白对照组用生理盐水雾化作为对照。末次激发小鼠哮喘24 h后，麻醉处死各组小鼠，检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和外周血中IgE和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素5(IL-5)、IL-13等细胞因子的含量，HE染色观察肺组织病理学改变。 结果:与空白对照组相比，哮喘模型组BALF和血清中的IgE含量增加(均 P<0.05)，BALF中IFN-γ/IL-5下降( P<0.01)。与哮喘模型组相比，免疫预防组BALF中IL-13含量降低( P<0.01)，BALF和血清中IFN-γ/IL-5升高(均 P<0.05)。小鼠肺组织病理切片HE染色结果表明，与空白对照组相比，哮喘模型组小鼠肺组织结构出现明显损伤，气道黏膜上皮细胞局部脱落，管壁及基底膜显著增厚，气道及血管周围可见大量炎症细胞浸润；与哮喘模型组相比，免疫预防组小鼠肺组织中的炎症性病理改变明显减轻。 结论:利用卵清蛋白成功诱导小鼠气道炎症，建立小鼠哮喘模型。Ad-AE-R2黏膜免疫可以提升小鼠气道Th1型免疫反应，促进Th1/Th2型细胞因子平衡，对小鼠哮喘具有一定的预防保护效果，为哮喘的免疫预防提供研究参考。

为探究鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)强毒株LY20810 F1与其传代弱毒株LY20810 F110的特性差异,比较了两个菌株的生物学特征、毒力基因序列、致病力及引起大口黑鲈免疫反应的差异,并评价了弱毒株LY20810 F110对大口黑鲈的免疫保护效果.结果表明,通过BHI培养基连续传代培养110代次后,菌株LY20810F110的菌落、菌体形态发生显著变化,其生长速度较原始毒株LY20810F1快1倍以上.通过比较两株菌的10个毒力基因序列,发现菌株LY20810 F110的SodC和ESAT6基因发生了单位点突变.致病力测试结果显示,强毒株LY20810F1以0.1 mL 1×107 cfu/mL攻毒剂量感染大口黑鲈,30d内鱼累积死亡率为100％,而传代弱毒株LY20810F110在相同剂量下未造成鱼死亡.强毒株LY20810 F1攻毒3d后引起脾脏、头肾中IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-γ等炎症细胞因子显著上调,表明细菌感染引起炎症风暴.传代弱毒株LY20810F110在感染中后期(14d和28d)诱导包括IgM、CD4-α、CD8-α、MHCI-α等8种免疫因子的上调.免疫效果评价结果显示,弱毒株LY20810F110的注射、浸泡免疫(1×108 cfu/mL)对大口黑鲈的相对保护率分别为75.0％和66.7％,有效降低了鱼诺卡氏菌入侵造成大口黑鲈脾脏和头肾的病理损伤.以上结果表明,鱼诺卡氏菌传代弱毒株LY20810F110是安全有效的弱毒疫苗候选株,将为诺卡氏菌减毒疫苗的研制提供科学依据.

目的 评价结核分枝杆菌(MTB)潜伏相关抗原Rv1737c用于活动性肺结核(ATB)和潜伏性结核病感染(LT-BI)的诊断价值.方法 纳入西安交通大学第一附属医院感染科2022年1月—2023年8月294例ATB病例和299例LTBI病例.用荧光斑点(FluoroSpot)法检测特异性T细胞经MTB毒力因子ESAT-6和CFP-10、MTB潜伏相关抗原Rv1737c刺激后分泌的IFN-γ和IL-2.受试者操作特征(ROC)曲线用于定义在区分ATB和LTBI时潜伏期相关抗原的最佳截断值.结果 在MTB特异性ESAT-6和CFP-10肽刺激后,ATB组仅分泌IFN-γ的T细胞(IFN-γ+T细胞)百分比显著高于LTBI组(P<0.001);相反,仅分泌IL-2的T细胞(IL-2+T细胞)百分比显著低于LTBI组(P<0.001).MTB潜伏相关抗原Rv1737c刺激后,LTBI组IL-2+T细胞百分比显著高于ATB组(P<0.001).由Rv1737c刺激的IL-2+T细胞百分比得出的ROC曲线下面积(AUC)为0.812(95%CI:[0.775,0.850]),区分ATB和LTBI的敏感性和特异性分别为81.9%和84.4%.仅考虑ESAT-6或CFP-10刺激的IFN-γ+T细胞百分比,ESAT-6及CFP-10 FluoroSpot对ATB和LTBI鉴别诊断的敏感性和特异性分别为77.6%和75.3%,AUC值为0.739(95%CI:[0.695,0.782]).在ESAT-6和CFP-10 FluoroSpot的基础上,与Rv1737c联合使用可将特异性提高到92.3%(95%CI:[0.872,0.994]),AUC增加至0.881(95%CI:[0.853,0.910]).结论 Rv1737c与ESAT-6和CFP-10结合,可作为基于T细胞的结核病诊断测试的候选抗原,用于区分ATB和LTBI.

目的:探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)联合血清糖类抗原125(CA125)、γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)对肺结核合并糖尿病的诊断价值.方法:选取2021年1月～2023年1月上海中医药大学附属第七人民医院收治的480例疑似肺结核患者,根据诊断结果分为A组(肺结核合并糖尿病患者)166例、B组(单纯肺结核患者)214例、C组(非结核分枝杆菌感染和非糖尿病患者)100例.所有研究对象均进行T-SPOT.TB,并采用酶联免疫吸附法检测血清CA125、IP-10水平.通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析T-SPOT.TB联合血清CA125、IP-10水平对肺结核合并糖尿病的诊断价值.结果:A组T-SPOT.TB阳性率低于B组,但高于C组,B组T-SPOT.TB阳性率高于C组(P＜0.05);A组抗原培养滤液蛋白10(CFP10)、早期分泌性抗原靶蛋白6-kD(ESAT-6)原值高于B组、C组,B组抗原CFP10、抗原ESAT-6原值高于C组(P＜0.05).A组血清CA125、IP-10水平高于B组和 C,B 组血清 CA125、IP-10 水平高于 C 组(P＜0.05).ROC 曲线分析显示,T-SPOT.TB、CA125、IP-10、T-SPOT.TB+CA125、T-SPOT.TB+IP-10、三项联合诊断肺结核合并糖尿病的曲线下面积(AUC)分别为0.771、0.769、0.779、0.880、0.885、0.937;三项联合诊断肺结核合并糖尿病的AUC大于T-SPOT.TB、CA125、IP-10单独和联合诊断.结论:肺结核合并糖尿病患者T-SPOT.TB阳性率和血清CA125、IP-10水平升高,T-SPOT.TB联合血清CA125、IP-10能提升肺结核合并糖尿病的诊断价值.

目的 原核系统表达与纯化结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)融合蛋白抗原Rv3425-16kD,检测其能否被活动性结核病(active tuberculosis,ATB)中肺结核患者和结核潜伏性感染(latent TB infection,LTBI)者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)识别,探讨作为诊断抗原鉴别活动性结核感染的可行性.方法 利用原核表达系统表达融合蛋白Rv3425-16kD并进行亲和纯化,以Western Blot法鉴定;收集结核病医学部收治的的ATB患者、LTBI者和健康人外周血,分离PBMCs,分别用Rv3425-16kD融合蛋白、早期分泌靶抗原6/培养液蛋白10(ESAT-6/CFP10)和MTB全菌裂解液刺激后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR方法检测γ-干扰素(Interferon-γ,INF-γ)mRNA的表达,通过f检验分析刺激前后PBMCs IFN-γ mRNA的表达差异.结果 原核系统表达及纯化的Rv3425-16kD融合蛋白相对分子质量均为37kD.健康人PBMCs刺激前,IFN-γ mRNA表达量为4.2±1.6,MTB全菌裂解液刺激后为14.7±3.5,差异具有统计学意义(P＜0.001),另外两组刺激没有明显变化;ATB患者PBMCs刺激前,IFN-γ mRNA表达量为3.7±1.2,经Rv3425-16kD融合蛋白、ESAT-6/CFP10抗原多肽和H37Rv全菌裂解液分别刺激后IFN-γ mR-NA 表达量为:166.0±29.7、13.7±5.8和213.0±33.5,三组抗原在刺激前后IFN-y mRNA表达量差异均具有统计学意义(P＜0.001).结论 原核重组的Rv3425-16kD融合蛋白可被ATB患者PBMCs细胞识别,具有较强抗原刺激作用和特异性,可用作MTB感染的预防及诊断.

目的 探讨淋巴细胞活化基因3(LAG-3)在活动性肺结核患者CD4+T细胞中的表达情况及其对CD4+T细胞功能的影响.方法 纳入2020年5月-2021年5月就诊于苏州大学附属传染病医院的25例初治活动性肺结核患者作为病例组,20名健康体检者作为对照组,流式细胞术检测外周血和支气管肺泡灌洗液中LAG-3+CD4+T细胞的比例;体外用结核分枝杆菌特异性抗原早期分泌靶抗原6 000 Mr与培养滤过蛋白10 000 Mr(ESAT-6/CFP10)刺激结核患者的外周血单个核细胞(PBMC),分为ESAT-6/CFP组和不加ESAT-6/CFP蛋白的Control组,探究LAG-3在结核特异性CD4+T细胞上的表达;用可溶性LAG-3(sLAG-3)蛋白抑制LAG-3分子信号通路,作为sLAG-3组,探究LAG-3对CD4+T细胞功能的影响.结果 病例组患者PBMC和支气管肺泡灌洗液(BALF)中LAG-3+CD4+T细胞比例升高,治疗后下降,差异均有统计学意义(t=2.291、3.045,P均＜0.05).经过ESAT-6/CFP10刺激后的ESAT-6/CFP10组CD4+T细胞上LAG-3的表达上调,而干扰素-γ(IFN-γ)的表达下降,与Control组相比差异均有统计学意义(t=6.174、3.476,P均＜0.05).抑制 LAG-3 分子信号后,与 ESAT-6/CFP10组相比,sLAG-3 组 CD4+T 细胞上 IFN-γ 和Granzyme B的表达升高,差异均有统计学意义(t=3.882、3.205,P=0.178、0.033).结论 活动性肺结核患者体内CD4+T细胞上LAG-3的表达升高,抗结核治疗后下降,LAG-3可能可以通过抑制CD4+T细胞IFN-γ的分泌,损害CD4+T细胞抗结核分枝杆菌的能力.

结核分枝杆菌(MTB)引起的结核病是一种慢性呼吸道传染病,研制载体介导的ESAT-6疫苗是当前的热点之一,ESAT-6抗原是一种公认的疫苗分子.本研究概述了卡介苗、耻垢分支杆菌、母牛分支杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、格式链球菌、单核细胞增生性李斯特菌、根癌农杆菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、毕赤酵母、流感病毒、高度减毒的牛痘病毒、腺病毒血清型5、慢病毒和昆虫杆状病毒等载体介导的结核分枝杆菌ESAT-6疫苗的研制现状.