目的 探讨组蛋白赖氨酸甲基转移酶2(SMYD2)介导体外高糖环境下小鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)活化的可能机制.方法 复制糖尿病(DM)小鼠模型,经全自动生化分析仪检测各组小鼠血糖(BG)、血肌酐(Scr)水平,经苏木精-伊红、Masson染色观察小鼠肾组织病理改变,经Western blotting检测各组小鼠肾组织纤维连接蛋白(Fibronectin)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)、SMYD2、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65(NF-κB p-p65)蛋白表达,经免疫荧光检测各组小鼠肾组织α-SMA及SMYD2表达.复制体外DM细胞模型,使用正常糖(含5.5 mmol/L葡萄糖)或高糖(含30.0 mmol/L葡萄糖)处理NRK-49F细胞,经Western blotting检测SMYD2、α-SMA及细胞外基质(ECM)成分蛋白表达;经CCK-8法检测SMYD2特异性抑制剂AZ505的细胞毒性;在AZ505处理/不处理的条件下,经Western blotting检测SMYD2、α-SMA、H3K4me3、Fibronectin、CollagenⅠ、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白表达,经免疫荧光检测α-SMA、SMYD2及NF-κB p-p65在细胞中的表达及空间定位情况.结果 DM组血清BG、Scr水平高于NC组(P<0.05).DM组肾组织α-SMA、Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p-p65蛋白相对表达量高于NC组(P<0.05),两组NF-κB p65蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05).HG刺激不同时间点NRK-49F细胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05).40 μmol/L组、60 μmol/L组NRK-49F细胞存活率较0 μmol/L组低(P<0.05).HG组NRK-49F细胞Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2蛋白相对表达量较NG组高(P<0.05),HG + AZ505(20 μmol/L)组较HG组低(P<0.05).HG组NRK-49F细胞Fibronectin、CollagenⅠ、α-SMA、H3K4me3、SMYD2蛋白相对表达量较NG组高(P<0.05),HG+AZ505组较HG组低(P<0.05).HG组NRK-49F细胞NF-κB p-p65蛋白相对表达量较NG组高(P<0.05),HG+AZ505组较HG组低(P<0.05),各组小鼠NRK-49F细胞NF-κB p65蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 SMYD2可介导高糖诱导的NRK-49F细胞活化,其机制可能与激活NF-κB细胞信号通路有关.

目的:探讨雷公藤内酯醇(TPL)对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、凋亡和组蛋白H3K4甲基化的影响.方法:以人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象,在不同浓度(10、20、40、80、160 nmol/L) TPL中共培养不同时间(24h、48h、72 h)后,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;Westem blot法检测组蛋白H3K4me2、H3K4me3的甲基化状态,实时荧光定量RT-PCR分析组蛋白甲基化酶SMYD3和组蛋白去甲基化酶LSD1的表达水平.结果:TPL对RPMI8226细胞有明显的增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖性(P＜0.05);TPL对RPMI8226细胞有明显诱导凋亡的作用,并且随着TPL作用浓度的增加,细胞凋亡比例逐渐增加(P＜0.05);同时TPL还可以诱导RPMI8226细胞周期阻滞于G2/M期;TPL以浓度依赖性降低组蛋白H3K4me2、H3K4me3的甲基化水平(P＜0.05,P＜0.01),并抑制SMYD3和上调LSD1的表达(P＜0.05).结论:TPL可抑制RPMI8226细胞增殖、引起细胞周期阻滞于G2/M期,并诱导其凋亡;通过抑制组蛋白甲基化酶SMYD3和增强组蛋白去甲基化酶LSD1的表达,降低组蛋白H3K4me3和H3K4me2的甲基化水平,这可能是rPL诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡和抗肿瘤作用的机制之一.

目的 研究组蛋白H4第20位赖氨酸突变对细胞可能存在的影响并探究其分子机制,期望寻找作用于该位点的特异性蛋白,比如H4K20me3去甲基化酶.方法 建立能够表达羧基(C)末端带Flag-HA标签的组蛋白H4及其突变体H4K20M(赖氨酸突变为蛋氨酸),H4K20A(赖氨酸突变为丙氨酸)的HeLa S3细胞系.通过病毒感染法获得能够表达目的蛋白的细胞,碘化丙啶(PI)染色后进行流式细胞(FAGS)周期分析.制备单个核小体(mono nucleosome,mono-N),通过免疫共沉淀的方法得到相互作用蛋白复合物成分,银染观察蛋白组分的差异,将差异蛋白条带切割后进行质谱分析.结果 在病毒感染大约72h过表达K20M的HeLa S3细胞表型异常,主要表现为细胞体积和细胞核体积明显增大,并停止生长,不再分裂.FACS结果显示过表达H4K20M的细胞被阻滞在G2/M期,质谱结果表明在过表达K20M的细胞中RBBP4/7的表达量增高.结论 组蛋白H4第20位赖氨酸突变为蛋氨酸会阻滞细胞周期,而这种阻滞很可能由RBBP4/7所引起.

目的 探讨组蛋白甲基转移酶PR-Set7在亚砷酸钠致人永生化皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)DNA损伤中的作用机制.方法 将处于对数生长期的HaCaT细胞暴露于含终浓度分别为0(对照)、1.25、2.5、5、10 μmol/L亚砷酸钠的DMEM高糖培养基染毒24 h.采用MTT法测定HaCaT细胞的存活情况.另设对照(24h)组、亚砷酸钠(10 μmol/L,24 h)染毒组、PR-Set7小干扰RNA干扰组(SiPR-Set7,50 nmol/L,48 h)和联合暴露(50 nmol/L SiPR-Set7干扰48 h后,10 μmol/L亚砷酸钠暴露24 h)组.分别采用qRT-PCR法检测PR-Set7 mRNA的表达水平,采用Western blot法检测H4K20mel和PR-Set7蛋白的表达水平,采用单细胞凝胶电泳法检测DNA损伤水平.结果 与对照组相比,5、10 μmol/L亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞的存活率均较低,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,5、10 μmol/L亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞PR-Set7蛋白和mRNA的表达水平均升高,而H4K20me1蛋白的表达水平降低;2.5、5、10 μmol/L亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞尾部DNA％及尾矩升高,差异有统计学意义(P＜0.05).随着亚砷酸钠染毒浓度的升高,HaCaT细胞PR-Set7蛋白和mRNA的表达水平均呈上升趋势,而H4K20me1蛋白和mRNA的表达水平呈下降趋势,DNA损伤水平(尾部DNA％及尾矩)呈上升趋势.与对照组比较,SiPR-Set7干扰组HaCaT细胞PR-Set7蛋白的表达大幅下降;亚砷酸钠染毒组、SiPR-Set7干扰组和联合暴露组HaCaT细胞H4K20me 1蛋白的表达水平均降低,而尾部DNA％及尾矩均升高,差异有统计学意义(P＜0.05).与亚砷酸钠染毒组比较,联合暴露组HaCaT细胞PR-Set7蛋白和mRNA以及H4K20me1蛋白的表达均降低,而HaCaT细胞尾部DNA％及尾矩均升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在对HaCaT细胞进行PR-Set7干扰后,亚砷酸钠可能通过抑制组蛋白甲基转移酶PR-Set7蛋白及mRNA的表达水平,从而降低H4K20me1的修饰水平,影响HaCaT细胞DNA损伤修复能力,使DNA损伤加重.

目的 了解不同剂量亚砷酸钠(NaAsO2)对人永生化皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)碱基切除修复(BER)基因聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1(PARP1)、N-甲基化嘌呤-DNA-糖基化酶(MPG)、X射线修复交叉互补基因-1(XRCC1)启动子区和编码区组蛋白H4第20位赖氨酸-甲基化(H4K20me1)修饰水平及其mRNA转录水平的影响.方法 以0.00、2.50、5.00、10.00 μmol/L的NaAsO2处理HaCaT细胞24 h.应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MPG、PARP1、XRCC1基因mRNA表达水平;定量染色质免疫沉淀技术(CHIP-qPCR)检测MPG、PARP1、XRCC1基因启动子区(CHIP1、CHIP2区域)和编码区(CHIP3、CHIP4区域)H4K20me1修饰水平.结果 (1) MPG、PARP1、XRCC1基因mRNA表达水平检测结果:2.5 μmol/L染砷组MPG、PARP1、XRCC1基因mRNA表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P＞ 0.05),5.00、10.00 μmol/L组mRNA表达水平随染毒剂量的增加而降低,与对照组比较,各差异有统计学意义(P＜ 0.05).(2)MPG、PARP1、XRCC1基因启动子区和编码区组蛋白H4K20me1修饰水平检测结果:基因启动子区,不同染砷组HaCaT细胞MPG基因启动子CHIP1、CHIP2区和PARP1基因启动子CHIP2区未观察到H4K20me1的富集规律,与对照组相比各差异无统计学意义(P＞0.05),5.00、10.00 μmol/L染毒组HaCaT细胞XRCC1基因启动子CHIP1、CHIP2区和10.00 μmol/L染毒组PARP1基因启动子CHIP1区H4K20me1的富集与对照组相比明显减少,各差异有统计学意义(P＜0.05);基因编码区,5.00、10.00μmol/L染毒组HaCaT细胞MPG、PARP1、XRCC1基因编码CHIP3、CHIP4区H4K20me1的富集与对照组相比明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 NaAsO2可通过抑制HaCaT细胞PARP1、XRCC1基因启动子区和MPG、PARP1、XRCC1基因编码区H4K20me1的表达水平,使MPG、PARP1、XRCC1基因mRNA转录水平下降.

目的 观察饮水砷暴露对人群外周血白细胞中组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)和H3第79位赖氨酸三甲基化(H3K79me3)修饰水平的影响,分析砷暴露与H3K4me3和H3K79me3修饰水平的关系.方法 采用整群抽样的调查方法,在山西省和吉林省饮水型地方性砷中毒典型病区开展现场调查,选择饮水年限≥10年的当地常住居民281人作为调查对象.受检人群按照饮用水砷含量分为对照组(水砷含量≤0.01 mg/L,60例)、低水砷暴露组(＞0.01～0.05 mg/L,61例)、中水砷暴露组(＞0.05～0.10 mg/L,50例)、高水砷暴露组(＞ 0.10 mg/L,110例).采集调查对象的饮用水样、即时尿样和外周血样.采用原子荧光法检测饮水砷含量和尿砷含量:斑点杂交方法(Dot Blotting)检测外周血白细胞中组蛋白H3K4me3和H3K79me3的修饰水平.结果 对照组,低、中、高水砷暴露组间年龄(61.50、60.00、59.50、59.50岁)、性别(男:20、27、17、40例,女:40、34、33、70例)、体质指数(BMI)、吸烟及饮酒情况比较,差异无统计学意义(P均＞0.05).对照组,低、中、高水砷暴露组水砷含量中位数分别为0.005、0.024、0.076、0.150 mg/L;尿砷含量中位数分别为0.011、0.018、0.061、0.134 mg/L;水砷累积暴露量中位数分别为0.342、1.641、5.273、7.716 mg,组间比较差异有统计学意义(H=256.041、88.615、218.610,P均＜0.01).对照组,低、中、高水砷暴露组人群外周血白细胞中H3K4me3(0.100、0.059、0.083、0.083)、H3K79me3 (0.049、0.036、0.055、0.052)修饰水平比较,差异无统计学意义(H=1.488、2.097,P均＞0.05).外周血白细胞H3K4me3、H3K79me3修饰水平与水砷含量、尿砷含量、水砷累积暴露量呈正相关关系(r=0.245、0.221,0.299、0.318,0.149、0.149,P＜0.01或＜0.05);H3K4me3与H3K79me3修饰水平之间呈正相关关系(r=0.811,P＜0.01).结论 饮水砷暴露虽然与人群外周血白细胞中H3K4me3和H3K79me3修饰水平存在正相关关系,但仍需扩大样本量进一步研究.

真核生物的DNA复制是一个复杂且有序的过程,其中DNA复制起始参与调控众多生物学活动,对生物正常的生长发育具有重要作用.组蛋白修饰在调节DNA复制过程中具有重要作用.为了检测组蛋白特定位点的修饰对DNA复制起始的影响,本研究以酿酒酵母组蛋白H3/H4定点突变菌株为研究对象,采用倍比稀释表型分析法检测了组蛋白11种H3/H4甲基化、乙酰化突变菌株的生长情况,显示,以野生型菌株BY4741为对照,组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K64A、H3K56A、H3K14Q、H4K5R、H4K16Q以及组蛋白H4甲基化突变菌株H4K20Q表现为生长缺陷,其他菌株与BY4741生长情况基本一致;通过GeNorm和NormFinder软件分析得出本实验最适内参基因为β-actin;采用Real-time PCR检测了菌株细胞内复制起始相关蛋白基因mcm2、mcm10、cdc45的表达情况,表明,组蛋白H3/H4甲基化突变菌株H3K9A、H3R72K、H4K59A、H4K20Q胞内mcm2、mcm10、cdc45基因表达均显著下调(p＜0.01),而H4R3A胞内mc m2、mcm10表达显著上调(p＜0.05)、cdc45显著下调(p＜0.01),组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K14Q、H4K5R、H4K8A、H4K16Q胞内mcm2表达显著下调(p＜0.01),而在H3K64A、H3K56A胞内无显著变化,mcm10在6种组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株内表达均下调(p＜0.01),cdc45基因在H4K5R胞内表达无显著变化,在其余5种乙酰化突变菌株中表达均显著下调(p＜0.01),为进一步阐明组蛋白特定位点修饰调控DNA复制起始的深入研究提供理论帮助.

目的 探讨赖氨酸甲基转移酶PR-Set7和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)对亚砷酸钠调控人永生化皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)碱基切除修复(BER)基因组蛋白H4第20位赖氨酸一甲基化(H4K20me1)修饰水平的影响.方法 体外培养HaCaT细胞,设对照(24h)组、NaAsO2(10.00 μmol/L,24h)染毒组、赖氨酸甲基转移酶PR-Set7小干扰RNA(siPR-Set7)干扰组(50 nmol/L,siPR-Set7,48 h)、siPR-Set7+NaAsO2组(50 nmol/L siPR-Set7干扰48 h后,10.00 μmol/LNaAsO2处理24 h)和SAM+NaAsO2组(SAM处理1h后10.00 μmol/LNaAsO2处理24 h),染色质免疫共沉淀(CHIP)检测N-甲基化嘌呤-DNA-糖基化酶(MPG)、聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1(PARP1)、X射线修复交叉互补基因-1(XRCC1)基因启动子区(CHIP1、CHIP2区域)和编码区(CHIP3、CHIP4区域)H4K20me1修饰水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MPG、PARP1、XRCC1基因mRNA表达水平.结果 与对照组比较,NaAsO2染毒组、siPR-Set7组和siPR-Set7+NaAsO2组MPG、PARP1基因启动子CHIP1区及XRCC1基因启动子CHIP2区H4K20me1富集减少,SAM+NaAsO2组MPG、PARP1基因启动子CHIP1和CHIP2区及XRCC1基因启动子CHIP1区H4K20me1富集减少;与NaAsO2染毒组比较,siPR-Set7+NaAsO2组PARP1基因启动子CHIP1区、XRCC1基因启动子CHIP2区H4K20me1富集减少,SAM+NaAsO2组PA RP1基因启动子CHIP1区及XRCC1基因启动子CHIP2区H4K20me1富集增加(P均＜0.05).与对照组比较,NaAsO2染毒组、siPR-Set7组和siPR-Set7+NaAsO2组MPG基因编码CHIP4区及PARP1、XRCC1基因编码CHIP3和CHIP4区H4K20me1富集减少,SAM+NaAsO2组MPC基因编码CHIP3和CHIP4区及PARP1、XRCC1基因编码CHIP3区H4K20me1富集减少;与NaAsO2染毒组比较,siPR-Set7+NaAsO2组MPG基因编码CHIP4区及PARP1、XRCC1基因编码CHIP3和CHIP4区H4K20me1富集减少,SAM+NaAsO2组MPG、PARP1、XRCC1基因编码CHIP3和CHIP4区H4K20me1富集增加(P均＜0.05).与对照组比较,NaAsO2染毒组、siPR-Set7组、siPR-Set7+NaAsO2组和SAM+NaAsO2组MPG、XRCC1、PARP1 mRNA表达降低;与NaAsO2染毒组比较,siPR-Set7+NaAsO2组XRCC1、PARP1mRNA表达降低,SAM+NaAsO2组MPG、PARP1、XRCC1 mRNA表达升高(P均＜0.05).结论 NaAsO2可激活PR-Set7的表达,但由于甲基供体SAM不足,亦导致MPG、PARP1、XRCC1基因H4K20me1富集水平降低,进而使MPG、PARP1、XRCC1 mRNA表达水平降低,参与砷致细胞DNA损伤过程.

组蛋白甲基转移酶SUV4-20H为哺乳动物组蛋白H4第20位赖氨酸(H4K20)的特异性甲基转移酶,在人体组织中广泛表达.SUV4-20H蛋白本身及其介导的H4K20甲基化修饰,均可导致染色质致密化及基因抑制,从而影响调控基因的转录与表达.近年来,随着国内外学者的深入研究,SUV4-20H基因及其编码蛋白在组织器官发育、肿瘤疾病等生理及病理生理过程中的作用机制逐渐被揭示.本文对SUV4-20H基因及其编码蛋白的生物学特征及其在疾病发生发展过程中的作用进行综述,以期进一步理解甲基化转移酶对基因表达调控的影响,为相关疾病的预防和诊治奠定理论基础.

目的:探讨二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的可能分子机制.方法:用不同浓度二甲双胍(0、5、10和20 mmol/L)处理卵巢癌HO8910和SKOV3细胞,EdU和迁移实验检测细胞增殖和迁移能力;免疫印迹和qRT-PCR检测细胞内赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)蛋白及mRNA表达水平;免疫印迹检测PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平.建立诱导型稳定敲低LSD1的卵巢癌HO8910和SKOV3细胞株,经10 mmol/L二甲双胍处理,通过EdU和迁移实验检测各组细胞增殖和迁移能力.结果:与对照组相比,不同浓度二甲双胍处理组细胞增殖和迁移能力明显降低(P均<0.01),LSD1蛋白表达水平明显降低,LSD1特异性底物H3K4me2蛋白表达水平明显升高(P均<0.01);PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K和p-AKT表达水平明显降低(P均<0.01).二甲双胍处理和敲低LSD1后,细胞增殖和迁移能力均显著降低(P<0.05).结论:二甲双胍可能通过抑制PI3K/AKT通路下调LSD1蛋白表达,从而抑制卵巢癌细胞增殖与迁移.