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高致病性猪链球菌双组分系统Ihk/Irr双基因缺失突变株的构建
编辑人员丨2023/8/6
目的 构建Ⅱ型猪链球菌05ZYH33菌株双组分系统Ihk/Irr的双基因缺失突变株.方法 首先对双组分系统 Ihk/Irr基因进行序列分析;选取Ihk/Irr基因的相关片段克隆至pET30a表达载体,进行可溶表达并注射家兔制备抗体;分别将ihk基因上游irr基因下游各1 kb的片段扩增,将两个片段连接起来;克隆至温敏型pJRS233的穿梭质粒中;利用两步同源重组法获得突变体;分别提取突变株的基因组DNA,RNA及菌体总蛋白,利用PCR, RT-PCR,Western-blot方法验证突变体.结果 成功制备了双组分系统Ihk/Irr可溶性表达的蛋白,成功构建了重组的温敏型ikr-pJRS233重组质粒,成功将重组质粒转入猪链球菌05ZYH33中并获得突变株,基因组PCR,RT-PCR及Western-blot分别证实了双组分系统Ihk/Irr双基因被成功敲除.结论 成功构建重组温敏型的穿梭质粒,导入到猪链球菌05ZYH33菌株中经两步同源重组获得突变株,在基因组DNA,RNA及蛋白水平上验证了双组分系统Ihk/Irr双基因缺失株的成功构建.
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编辑人员丨2023/8/6
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