目的 探究泛素特异蛋白酶10(USP10)对肝细胞癌(HCC)中Krüppe样因子4(KLF4)蛋白的调控及对HCC细胞增殖与侵袭的影响.方法 采用Western blot实验检测USP10和KLF4在人正常肝细胞系L02和HCC细胞系HepG2、HUH7、HCCLM3等中的表达差异.选取HCCLM3和HUH7细胞,将过表达或沉默USP10的慢病毒颗粒(oe-USP10或sh-USP10)转染入细胞中,并将其记为oe-USP10组和oe-NC组.免疫共沉淀(Co-IP)实验检测HCCLM3或HUH7细胞中USP10是否可与KLF4直接结合.加入蛋白酶体抑制剂MG132,再次使用Co-IP检测转染oe-USP10或sh-USP10的HCCLM3和HUH7细胞中 KLF4蛋白的泛素化水平.将过表达KLF4的pcDNA3.1载体质粒及其阴性对照质粒(pc-KLF4 或 pc-NC)共转染入 HCCLM3 和 HUH7 的 sh-USP10组或sh-NC组细胞中,并将细胞记为sh-NC+pc-NC组、sh-USP10+pc-NC 组、sh-NC+pc-KLF4 组和 sh-USP10+pc-KLF4组,采用CCK-8法检测HCCLM3和HUH7中各组细胞的增殖活力,Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力.结果 与 L02 细胞比较,USP10 和 KLF4 在 HepG2、HUH7、HC-CLM3等细胞中蛋白表达均降低(P＜0.05).在HCCLM3和HUH7细胞中,USP10蛋白可直接与KLF4相互结合.同时,MG132处理后,HCCLM3和HUH7细胞中KLF4蛋白表达量呈时间依赖性增加.沉默USP10可增加HCCLM3与HUH7细胞中 KLF4的泛素化,过表达USP10可降低上述细胞中KLF4的泛素化水平.与sh-NC+pc-NC组比较,sh-USP10+pc-NC组中HCCLM3和HUH7的增殖和侵袭能力均升高(P＜0.01),而 sh-NC+pc-KLF4 组和 sh-USP10+pc-KLF4 组的HCCLM3或HUH7细胞增殖和侵袭能力均降低(P＜0.05);与 sh-USP10+pc-NC 组比较,sh-USP10+pc-KLF4 组细胞的增殖和侵袭能力均降低(P＜0.05).结论 在HCC细胞中USP10通过去泛素化促进KLF4蛋白稳定性,进而抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭.

目的 探讨微小核糖核酸7(miR-7)靶向调控Krüppe样因子4(KLF4)对结肠癌干细胞生物学行为的影响.方法 体外传代培养结肠癌干细胞.取传15代、对数生长期、生长状态良好的结肠癌干细胞,随机分为对照组、NC mimics组、miR-7 mimics组,NC mimics组和miR-7 mimics组分别转染空载质粒、miR-7 mimics质粒,对照组不予转染.采用RT-qPCR法验证转染效率.收集各组转染48 h结肠癌干细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用改良Boyden小室法检测细胞侵袭能力,采用流式细胞术检测细胞凋亡率.通过TargetScan在线网站预测miR-7与KLF4的结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-7对KLF4的靶向调控作用.收集各组转染48 h结肠癌干细胞,分别采用RT-qPCR法、Western blotting法检测KLF4 mRNA和蛋白表达.结果 miR-7 mimics组miR-7相对表达量高于对照组和NC mimics组(P均<0.05),而对照组与NC mimics组比较差异无统计学意义(P>0.05).miR-7 mimics组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数均低于NC mimics组和对照组,细胞凋亡率高于NC mimics组和对照组(P均<0.05);NC mimics组与对照组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数、细胞凋亡率比较差异均无统计学意义(P均>0.05).经TargetScan在线网站预测,KLF4基因的3′非翻译区存在miR-7的结合位点;经双荧光素酶报告基因实验验证,miR-7对KLF4存在靶向调控作用.miR-7 mimics组KLF4 mRNA与蛋白相对表达量均低于NC mimics组和对照组(P均<0.05),而NC mimics组与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 miR-7可通过靶向下调KLF4表达而抑制结肠癌干细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡.