目的 基于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术建立瘦素受体基因(leptin receptor,Lepr)与血管内皮一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxide synthase,eNos)双基因敲除(double-knockout,DKO)小鼠模型,构建晚期糖尿病肾病小鼠模型.方法 根据eNos基因制备对应的gRNA,将CRISPR-Cas9 体系显微注射于C57BL/Ks(BKS)背景小鼠的受精卵内.将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部.幼鼠出生后经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定及测序分析分选出为eNos+/-基因型的F0 代阳性小鼠,获得BKS背景下的Lepr基因杂合小鼠,即基因型为Leprdb/m 的Lepr-F0 代杂合子小鼠.将eNos-F0 与Lepr-F0 代小鼠杂交,获得eNos+/-/Leprdb/m 双杂合F1 代小鼠,将双杂合F1 代小鼠进一步交配,筛选得到Lepr与eNos双基因敲除小鼠.采用PCR法鉴定小鼠基因型,按基因鉴定结果 分为野生型(wild-type,WT)组与DKO组小鼠.监测各组小鼠体质量、血糖与饮水进食量;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠尿白蛋白与尿肌酐水平,并计算尿白蛋白排泄率;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)与过碘酸六胺银(periodic acid-silver metheramine,PASM)染色检查各组小鼠肾组织病理改变.结果 PCR检测结果 显示,成功构建leprdb/db/eNos-/-DKO小鼠.与同窝对照组相比,DKO小鼠的体质量、血糖水平与饮水进食量均显著高于同窝对照小鼠.DKO小鼠的尿白蛋白与尿白蛋白排泄率显著高于WT小鼠.病理学结果 显示,DKO小鼠的肾小球体积明显增大,系膜基质增生明显.结论 基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术可成功构建leprdb/db/eNos-/-DKO小鼠,DKO小鼠可反映糖尿病肾病的典型表现,为深入研究糖尿病肾病的作用机制提供动物模型.

利用自发2型糖尿病基因工程Leprdb/db小鼠糖尿病小鼠模型,探讨穿心莲内酯(andrographolide,Andro)对糖尿病肾病的作用及机制.利用试剂盒检测Andro治疗Leprdb/db小鼠24 h后的尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平;利用HE染色和PAS染色分别检测Andro对糖尿病小鼠肾脏组织的病理改变和还原糖水平的影响;采用免疫组织化学染色法检测Andro对Leprdb/db小鼠肾脏的纤维粘连蛋白(FN)和NOX-4的影响.结果显示,Andro治疗组(1 mg/kg,ip)的24 h后Leprdb/db小鼠的尿蛋白、血肌酐和血尿素氮等生化指标水平明显低于对照组,Andro能抑制Leprdb/db小鼠肾脏的病理改变和FN、NOX-4的表达,表明Andro可以显著改善自发2型糖尿病基因工程小鼠Leprdb/db小鼠的糖尿病肾病.

目的 检测瘦素受体缺陷的Leprdb/db小鼠体内肝、肾中硫辛酸合成酶(LIAS)的表达.方法 分别选取10周龄Leprdb/ +与Leprdb/db雄性小鼠各8只,禁食8 h后,测量两组小鼠体重及空腹血糖(FPG);用乙醚麻醉动物,经腹主动脉采血,处死动物,取肝、肾并称重.取肝右叶和左肾经4%多聚甲醛固定,进行肝、肾组织病理学检查.分离血清,用试剂盒检测血清中CHO、TG、HDL、LDL含量.应用线粒体分离试剂盒分离肝、肾组织线粒体,提取总蛋白,采用western blot方法检测 LIAS蛋白的表达.结果 组织病理观察,发现 Leprdb/ +小鼠肝肾结构完整,而Leprdb/db小鼠肝细胞出现脂肪变性,肾小球肥大,基底膜增厚,系膜区增宽;与Leprdb/ +小鼠比较,Leprdb/db小鼠体重、GLU、CHO、TG、LDL及AST明显增高,差异有显著性(P<0.05);与Leprdb/ +小鼠比较,Leprdb/db小鼠肝肾线粒体内LIAS蛋白表达量均增高,差异有显著性(P<0.05).结论 瘦素受体缺陷的Leprdb/db小鼠存在糖脂代谢紊乱、肝肾细胞损伤、肝肾组织线粒体LIAS蛋白的表达增高.

目的 探讨瘦素受体完全缺陷的Lepredb/db小鼠肾损伤机制.方法 选取28周龄瘦素受体杂合缺陷的Leprdb/+(作为对照)与Leprdb/db雄性小鼠各10只,禁食8h后,分别测量两组小鼠体质量、空腹血糖(FBG)和糖化血红蛋白(HbAlc)水平.小鼠经股动脉采血后处死.采用试剂盒检测血清中肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的水平.酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平.取肾进行病理观察.Western blot检测肾组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)及核因子-κB(NF-κB)蛋白表达.提取肾组织细胞线粒体,Western blot检测线粒体中硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,LIAS)蛋白的表达水平.结果 与Le prdb/+小鼠相比,Lepdb/db小鼠体质量、FPG、HbAlc、CRE、BUN水平均升高,差异有统计学意义(P＜0.05).病理观察发现,Leprdb/+小鼠肾细胞结构完整,而Leprdbdb/db小鼠肾小球体积增大,基底膜及毛细血管壁增厚,系膜细胞和系膜基质增多.与Leprdb/+小鼠相比,Leprdb/db小鼠血清中GSH水平降低,MDA和炎性因子MCP-1、IL-1β、TNF-α水平均升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);Leprdb/db组小鼠肾脏线粒体内LIAS和肾组织中Nrf2蛋白表达量均降低,而NF-κB蛋白水平升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 28周龄Leprdb/db小鼠存在氧化应激和炎症反应,肾损伤机制可能与LIAS调控Nrf2和NF-κB有关.

目的 在构建2型糖尿病小鼠下腔静脉移植模型的基础上,观察糖尿病对移植术后桥静脉再狭窄后血管平滑肌的影响.方法 取20只8周龄雄性自发2型糖尿病C57 BL/KsJ leprdb/db(db/db)小鼠和20只C57 BL/KsJ野生型小鼠,建立下腔静脉-颈总动脉旁路移植手术动物模型,通过超声评估移植后血管血流及血管直径.应用苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化染色观察静脉移植术后形态及平滑肌细胞标志蛋白表达水平,评估糖尿病对小鼠移植静脉再狭窄和血管平滑肌功能的影响.结果 超声结果显示,db/db小鼠移植静脉血管直径及血流速度均显著低于正常小鼠.形态学染色结果显示,与正常对照组比较,db/db小鼠静脉移植术后桥静脉血管壁厚度明显增加,α-SMA阳性的平滑肌细胞分布明显多于对照组,中膜平滑肌细胞占血管壁比例增加.结论 糖尿病是移植静脉再狭窄的不利因素,利用db/db小鼠进行静脉移植后,能够改善糖尿病小鼠冠状动脉搭桥术后移植静脉再狭窄的状况.为临床提供了实验依据.

目的:探讨达格列净对2型糖尿病小鼠心、肾的保护作用.方法:选取24只6周龄的雄性2型糖尿病模型(C57BLKS/J-leprdb/leprdb,db/db)小鼠,随机等分成达格列净投药组和对照组,另选取同周龄雄性非糖尿病的(C57BLKS/J-leprdb/+,db/m)小鼠12只作为正常组.检测小鼠血糖后,从第7周开始对投药组小鼠进行为期10周的达格列净用药,其余小鼠给予同等计量生理盐水,期间定期监测血糖、血压、尿糖以及各项代谢相关指标.投药结束后分离心脏及肾脏组织,组织切片进行染色观察.结果:与对照组相比,投药组达格列净用药后第1周血糖值显著降低(P＜0.01),用药9周后糖耐量测试结果显示血糖值几乎接近正常小鼠组水平,但各组间血压值无明显差异,心肌间质纤维化、炎性细胞浸润、氧化应激水平明显下降,同时肾小球硬化、炎性细胞浸润和氧化应激程度明显得到改善.结论:达格列净用药不仅能显著降低2型糖尿病模型小鼠血糖,还能有效抑制糖尿病引起的心血管及肾损害.

背景与目的 2型糖尿病(typeⅡdiabetes mellitus,DM2)是包括乳腺癌在内的多种癌症的危险因素.目前,尚未建立可用于研究的糖尿病乳腺癌小鼠模型.另外,调节癌症生长的糖尿病信号通路也尚未明确.在本研究中,我们建立了一个糖尿病乳腺癌小鼠模型,并证实了糖尿病在乳腺癌进展中的影响.方法 通过将瘦素受体突变(Leprdb/+)小鼠和MMTV-ErbB2/neu小鼠杂交,成功构建了人表皮生长因子受体2阳性(human epidermal growth factor receptor 2,Her2+或ERBB2)的乳腺癌转基因小鼠模型.用抗糖尿病药物治疗该小鼠模型来评价治疗DM2对肿瘤生长的影响.用磁共振波谱成像分析肿瘤代谢情况.结果 用二甲双胍/罗格列酮治疗MMTV-ErbB2/Leprdb/db小鼠模型可降低血清胰岛素水平,延长生存,降低肿瘤累积发生率,抑制肿瘤进展.超极化13C标记的丙酮酸/乳酸转换代谢流降低,表明抗胰岛素抵抗治疗抑制了体内实验中肿瘤糖酵解.用二甲双胍处理MMTV-ErbB2/Leprdb/db转基因小鼠来源的肿瘤细胞,降低了耗氧量和乳酸产量,使细胞代谢发生了重新编程.二甲双胍可降低Myc和丙酮酸激酶M2型同工酶(pyruvate kinase isozyme 2,PKM2)的表达,引起代谢重编程.另外,二甲双胍可阻断mTOR/AKT信号通路并改变脂肪因子谱.结论 MMTV-ErbB2/Leprdb/db转基因小鼠模型可用于糖尿病HER2+人乳腺癌的研究.本研究明确了糖尿病状态下HER2+人乳腺癌中失调的信号通路,该通路可被抗胰岛素抵抗治疗干预.

目的 探究miR-21靶向调控肾纤维化的发生发展机制,为临床糖尿病肾病(DN)的治疗提供新的思路.方法 24只C57BLKS/J-Leprdb/db小鼠随机分为实验1组、实验2组与对照组,每组8只.实验1组进行单侧肾切除术,术后2月,实验1组和实验2组小鼠采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病肾病动物模型.HE染色法观察肾组织病理学改变,Masson染色法观察肾组织纤维化状况,qRT-PCR法检测各组肾组织中LncRNA CASC7、miR-21、Wnt2b、SMAD7表达水平,western blot法检测Wnt2b和SMAD7的蛋白表达水平,荧光素酶报告系统鉴定LncRNA CASC7和miR-21靶向关系.Pearson相关性分析肾组织中LncRNA C4SC7和miR-21的表达水平与糖尿病肾病肾纤维化之间的关系.结果染色试验中观察到实验1组与实验2组小鼠肾小球肥大,系膜细胞及系膜基质增生,肾小管上皮细胞空泡变性.肾组织存在炎性细胞浸润、肾小管萎缩与间质纤维化.肾组织纤维化评分:实验1组(2.87±0.66)分＞实验2组(2.17±0.62)分＞对照组(0.57±0.14)分,差异有统计学意义(P＞0.05);LncRNA CASC7、miR-21、Wnt2b、SMAD7表达水平:实验1组＞实验2组＞对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);与对照组相比,实验1组和实验2组Wnt2b和SMAD7蛋白表达均升高,且实验1组高于实验2组,差异有统计学意义(P＜0.05);荧光素酶报告表明LncRNA CASC7可与miR-21靶向结合.Pearson相关性分析结果显示,肾组织中LncRNA CASC7和miR-21的表达水平与糖尿病肾病肾纤维化呈正相关(r=0.412、0.371,P均＜0.05).结论 LncRNA CASC7可通过调控下游miR-21改变Wnt2b、SMAD7的表达,从而参与调控Wnt2b、SMAD通路,并介导DN肾纤维化的发展.