目的 构建结核分枝杆菌rBCG-Rv2029c重组疫苗并鉴定.方法 通过PCR扩增Rv2029c抗原编码基因,然后用双酶切法将Rv2029c和pMV261质粒酶切,再将酶切产物连接成rpMV261-2029c重组质粒,用电穿孔法将该质粒导入BCG中构建成rBCG-Rv2029c重组疫苗,最后用SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的重组蛋白.结果 通过PCR成功扩增出1 020 bp的Rv2029c基因,插入到pMV261质粒中,再把融合基因成功导入BCG中,经双酶切及基因比对鉴定证实,再通过热诱导后用Western blotting显示重组蛋白具有免疫原性.结论 成功构建了结核分枝杆菌rBCG-Rv2029c重组活疫苗,为重组疫苗的免疫机制研究奠定基础.

目的 探讨结核分枝杆菌休眠存活调节子(DosR)蛋白Rv2029c对大肠埃希菌生长的影响,以探索其生物学功能.方法 根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列,设计Rv2029c特异性引物,采用原核表达的技术构建pET30a-Rv2029c重组质粒,并导入大肠埃希菌中进行表达.通过基因测序结果 ,确定正确质粒,将质粒负载大肠埃希菌,测定大肠埃希菌模式并绘制生长曲线.结果由于缺乏营养物质和氧气,空质粒组大肠埃希菌在6 h进入平台期,而携带有pE T 30a-Rv2029c的重组质粒能够促进大肠埃希菌突破生长界限,维持快速对数生长期长达10 h.结论 结核DosR蛋白Rv2029c能够促进大肠埃希菌生长,突破其生长界限,提高细菌应对低氧、营养物质缺乏等应激环境的能力,这可能与其在低氧环境下促进细菌的糖酵解能力有关.

目的 预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2029c的B/T细胞抗原表位,分析抗原位点的氨基酸变异.方法 BLAST在线分析Rv2029c与人类蛋白同源性,利用DNAstar软件包中的Protean软件预测Rv2029c潜在B/T细胞抗原表位,通过BioEdit软件比对NCBI数据库中所有结核分枝杆菌复合群Rv2029c氨基酸序列,找出变异位点.结果 Rv2029c与人类蛋白同源性较低.预测该蛋白共含有12个潜在B细胞抗原表位,分别位于5-13、32-49、85-88、97-102、106-113、147-161、165-172、178-183、220-227、262-264、318-326、334-339位氨基酸;含有6个T细胞表位数,分别位于23-36、53-66、135-170、207-223、271-289、307-318位氨基酸.除136和221位氨基酸外,不同地区来源的结核杆菌分离株Rv2029c蛋白氨基酸序列较少发生变异. 结论 结核分枝杆菌Rv2029c是一个B细胞抗原表位占优势的蛋白抗原,T细胞表位略少,且氨基酸序列较为保守,可作为结核监测、治疗、预防的新靶点.

目的:用结核分枝杆菌特异性抗原Rv2029构建结核重组疫苗(BCG-Rv2029),在C57BL/6小鼠体内评估其免疫效应,并初步探讨其免疫机制.方法:PCR扩增基因Rv2029,构建重组质粒pMV261-Rv2029,转入卡介苗感受态细胞中,诱导表达并纯化Rv2029蛋白.以重组的rBCG-Rv2029c活疫苗为免疫原,皮下免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA方法检测小鼠血抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度水平,XTT检测脾淋巴细胞抗原特异性增殖反应,流式细胞仪观察CD4+T和CD8+T细胞比例变化,IFN-γ、IL-2检测试剂盒检测细胞培养基中细胞因子表达水平.结果:成功构建重组疫苗BCG-Rv2029C,并诱导表达重组蛋白.经免疫小鼠后,重组卡介苗rBCG-Rv2029c能诱导较BCG更高的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度水平,IgG2a/IgG1的变化提示rBCG-Rv2029c可诱导Th1型免疫反应.与BCG相比,rBCG-Rv2029c可诱导产生更强的特异性细胞增殖反应、刺激产生更多的杀伤性CD8+T细胞和CD4+T细胞、能诱导产生更高水平的IFN-γ、IL-2细胞因子.结论:重组结核病疫苗rBCG-Rv2029c可诱导产生较BCG更强且针对休眠MTB的特异性体液免疫和细胞免疫,是一株值得深入研究的新型结核病疫苗.

为研究针对结核分枝杆菌潜伏感染的DNA疫苗,基于质粒A39构建了p-VAX1-Ag85B-Rv3425-Rv2029c-PPE26(V569)质粒DNA,并对其免疫原性及保护性进行初步研究.免疫性评价试验共分6组PBS、p-VAX1-Ag85B(A)、p-VAX1-Ag85B-Rv3425(A3)、A39、V569和BCG,采用左后腿肌内注射C57BL/6小鼠,用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测细胞免疫和体液免疫水平;构建斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染模型,将PBS、A、A3、A39、BCG、V569分别通过腹腔注射免疫斑马鱼后,每日注射地塞米松10 ug诱导海分枝杆菌复发感染,对斑马鱼肝脏进行菌落计数并绘制生存曲线.结果显示,与BCG组相比,V569能引发实验小鼠强烈的细胞免疫反应(IFN-γ高水平分泌),外周血CD4+/CD8+T细胞比例明显增加.在斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染复发模型中,与BCG免疫组相比,V569免疫斑马鱼后可显著减少其肝脏中海分枝杆菌数量,斑马鱼存活情况得到显著改善,表明V569 DNA疫苗可能是一种抗结核潜伏感染的候选DNA疫苗.