目的 探究不同生态类型菘蓝Isatis tinctoria表型差异和特异位点扩增片段测序(specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)分子标记.方法 以25个不同生态类型菘蓝为研究对象,利用SLAF-seq技术开发SLAF标签,再结合菘蓝叶片叶表观特征的田间观测,分析不同生态类型菘蓝植株表观差异.结果 测序后各样品所获得的读长总量各不相同,测序质量值Q30为95.66％～96.60％,GC比例为38.13％～41.37％.共开发535 105个菘蓝SLAF标签,多态性SLAF标签有34 412个,共得到63 002个群体单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记.测序分析结果与叶表观特征调查结果相结合,可以将25个不同生态类型菘蓝分为5类,分别为倒卵圆形无缺刻皱缩叶、倒卵圆形缺刻皱缩叶、倒卵圆形无缺刻平坦叶、倒卵圆形缺刻平坦叶、披针形无缺刻平坦叶.结论 为后期进一步研究不同类型菘蓝的基因来源和遗传进化提供参考,为菘蓝种质分类、品种鉴定和分子辅助育种提供借鉴.

研究应用SLAF-seq技术开发了短须裂腹鱼(Schizothoraxwangchiachii)的SNP标记,并使用开发的SNP标记分析了野生种群的遗传多样性.结果显示实验中RsaⅠ-HaeⅢ的酶切效率为86.93%,共得到80.08 M reads.通过生物信息学分析, 共获得709758个SLAF标签, 其中多态性的SLAF标签共有243304个, 共得到777082个群体SNP, 测序平均Q30为94.79%, 平均GC含量为40.16%, 测得观测等位基因数为2.005, 期望等位基因数为1.5272, 观测杂合度为0.2007, 期望杂合度为0.3160, 平均遗传距离为0.1523, 遗传多样性指数为0.3386,香浓指数为0.4827,多态性信息含量(PIC)为0.2562,次要基因型频率(MAF)为0.2313,结果表明目前金沙江阿海至龙开口段短须裂腹鱼野生种群遗传多样性处于中等水平, 这和人为干扰有关.近年来短须裂腹鱼数量逐年减少, 研究短须裂腹鱼的遗传多样性对保护其种质资源起着重要的作用.

开发大量木薯(Manihot esculenta)特异分子标记可促进木薯种质资源中优良基因的挖掘和利用.本研究以39份木薯种质资源为材料,利用特异性位点扩增片段测序(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF-seq)技术进行测序,结果显示:本次实验双端比对效率为90.83％,酶切效率为91.18％;通过测序获得304.30 Mb的读长数据,各样本读长范围在2 123 094～15 102 046之间,对照数据量最小,仅395 790个读长;样品测序质量值(Q30)在95.62％～96.60％之间,均在95％以上;GC含量在41.27％～44.96％之间,平均GC含量为42.89％,对照的GC含量为42.93％.本研究共开发出725 220个SLAF标签,样本的平均测序深度为20.98倍(×),多态性SLAF标签446 789个,共得到2 504 个群体SNP标记.可见,SLAF-seq技术适用于木薯SNP位点的开发,其效率较高.

大麦侧小穗结实与否导致了二棱/六棱性状的分化,从而显著影响其籽粒产量,因此大麦二棱到六棱的变化具有显著驯化特征.青藏高原野生和栽培大麦资源丰富,被认为是栽培大麦的驯化和遗传多样性中心之一.为进一步了解大麦棱数调控的遗传基础以及西藏栽培大麦驯化的过程,以西藏野生二棱大麦和六棱大麦地方品种为亲本构建遗传分离群体,遗传分析发现二棱性状受单个显性基因位点控制.通过集群分离法(Bulked segregant analysis,BSA)分别建立含有22个F2单株的二棱混池和六棱混池,基于SLAF-seq(Specific-locus amplified fragment sequencing)技术共获得456 691个SLAF标签,通过SNP-index和ED两种关联算法交集得到3个与棱数性状相关的侯选区域,总长度为53.84Mb,包含536个基因,其中能分别被3个数据库GO、KEGG和COG注释的基因有413、189和160个基因.上述研究实现了对控制西藏大麦侧小穗发育性状相关基因的初步定位,结果可为后续目标基因的精细定位和克隆提供理论参考.

带鱼(Trichiurus japonicus)是广泛分布于东亚大陆架海域的暖温性近底层鱼类,长期位居我国单鱼种渔获量第一位.自上世纪70年代以来,持续过度捕捞和海洋环境变化导致中国近海带鱼资源基础和遗传多样性受到严重影响,但有关带鱼种群的微卫星DNA标记研究却较为缺乏,不利于该物种遗传资源评估和保护.为此,本研究采用基于高通量测序平台的SLAF-seq技术,从带鱼的195 308个SLAF标签中识别出25 704个二至六碱基重复微卫星位点.经过引物扩增验证,最终筛选出36个具有多态性的微卫星标记.各位点等位基因数4～35,均值14.47.观测杂合度0.214～1.000,期望杂合度0.456～0.979,均值分别为0.620和0.803.所有位点的多态信息含量值均大于0.25.经Bonferroni校正,21个位点符合哈迪-温伯格平衡,且各位点间不存在连锁不平衡.这21个多态性微卫星标记可为带鱼的种群遗传资源研究提供新的有效分子标记和技术支撑.Bottleneck分析结果表明,宁波近海带鱼群体未检测到近期的遗传瓶颈效应,这可能与目前东海区带鱼野生群体数量还比较庞大、遗传变异仍然较为丰富有关.跨物种扩增结果显示,分别有12、16、4和3个带鱼微卫星标记在带鱼属(Trichiurus)、沙带鱼(Lepturacanthus savala)、窄颅带鱼(Tentoriceps cristatus)及小带鱼(Eupleurogrammus muticus)中具有较好的通用性,这些微卫星标记为今后带鱼科相应属、种的系统进化关系研究提供新的分析手段和契机.

叶缘裂刻性状是甘蓝型油菜遗传育种的理想形态标记.叶缘裂刻性状变异材料的创建对丰富甘蓝型油菜叶片形态和优良品种改良至关重要.本研究以甘蓝型油菜常规品种中双11和甘蓝型油菜叶缘裂刻新品系Y176为亲本(通过甘蓝型油菜与蔊菜远缘杂交获得),从F2群体中分别挑选出叶缘裂刻和正常叶形的植株各50株,构建了两个极端性状混池DNA文库,借助SLAF-seq-BSA技术,挖掘甘蓝型油菜叶缘裂刻性状相关候选基因.共开发出177941个SLAF标签,通过分析SLAF标签的多态性,共获得150168个SNP,其中亲本间共获得128200个SNP.对ED方法和SNP-index方法得到的关联区域进行综合分析,获得1个与目标性状紧密关联的候选区域,位于甘蓝型油菜A10染色体上的14528149～17353693区域,总长度为2.83 Mb,约有666个编码基因.与前人研究定位在同一染色体上,但本研究定位的区间与前人研究不同,说明本研究存在控制叶缘裂刻新基因的可能性大.并对该区域内基因进行功能注释,其中666个注释到NR数据库;517个注释到SwissProt数据库;587个注释到GO数据库;151个注释到KEGG通路;258个注释到COG数据库,对候选基因进行注释有助于进一步分离相关基因.

探明高粱育种材料的遗传结构和亲缘关系,为今后高粱杂交育种、种质创新及杂种优势群构建提供理论依据.采用简化基因组测序技术(Specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)对37份高粱材料进行测序,以高粱(Sorghum bicolor_v3.1)基因组为参考基因组进行酶切预测,以水稻品种日本晴为对照进行比对分析,开发单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记并将其应用于育种材料的遗传结构和亲缘关系分析.结果表明,从37份高粱材料中共获得106.19 Mb的读长数据,不同材料的读长个数在1461206-4628462;对照数据的双端比对效率为92.15％,酶切效率为89.69％,SLAF建库正常.测序质量值Q30平均为89.60％,所有样品GC含量均值为45.71％,共开发了226724个SLAF标签,其中多态性SLAF标签有105053个,通过序列分析共获得185451个有效标记.群体遗传结构分析和主成分分析都将37份高粱育种材料划分为2个类群,保持系和国外材料聚为一类,恢复系和中国材料聚为一类,分群结果与实际系谱基本相符.根据SNP标记估算材料间的遗传距离,距离值范围为0.0098-0.8841,L2R与L17R遗传距离最小,3765白B与L17R遗传距离最大.本研究明确了部分外引材料的血缘关系,并发现都拉类型、卡佛尔/顶尖类型的不育系与倾中国高粱的恢复系亲缘关系最远,在高粱杂交育种选配亲本上应加以重视.

利用简化基因组测序对澜沧江中上游的苗尾-功果桥库区、黄登-大华桥库区、里底江段和乌弄龙江段4个地理群体60个光唇裂腹鱼(Schizothorax lissolabiatus Tsao)样本进行了简化基因组测序,平均测序深度255.26X,Q30为94.96％,平均GC含量为39.80％;测序获得多态性SLAF标签252623个,SNP标记1151083个,其中,SNP平均完整度为36.66％,SNP平均杂合率为9.5％;通过测序结果进行遗传多样性分析,结果表明,观测等位基因数均为2,平均期望等位基因数为1.4211—1.5029,平均观测杂合度为0.2381—0.3131,平均期望杂合度为0.2690—0.3115,平均多样性指数为0.2868—03248,平均香浓指数为0.4269—0.481,平均次要基因频率(MAF)为0.1854—0.2216,平均多态信息含量(PIC)为0.2237—0.2553;AMOVA分析结果显示,在总的变异中,89.73％的遗传变异来自群体内部,10.27％的遗传变异来自于群体间,群体间遗传分化指数在–0.0150—0.1299(P<0.05),表明群体间存在不同程度的分化.4个群体间遗传距离为0.05—0.15,UPGMA聚类表明,苗尾-功果桥库区、黄登-大华桥库区和里底3个地理群体相互交叉聚类,乌弄龙地理群体单独聚为一类.综上,4个群体的遗传多样性处于中等水平,遗传距离及聚类结果与试验群体地理距离基本相符,研究结果将为光唇裂腹鱼种质资源评价与保护提供参考依据.

以我国长江中下游地区和北方地区33个居群的195份野莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)为材料,基于SLAF简化基因组测序技术,对不同区域野莲居群的遗传多样性进行研究.结果显示:通过测序共得到742992个SLAF标签,挖掘高质量SNP位点1064789个;供试材料基因型差异明显,主要可分为长江流域和东北区域2个亚群.研究结果支持长江流域野莲和东北区域野莲应分属为亚热带及温带生态型莲.我国野莲居群总多样性较低(π=1.04×10-5),居群间平均分化系数较高(FST=0.42).长江中下游地区不同湖泊野莲π值变幅为0.5×10-5～2.2×10-5,梁子湖野莲多样性最为丰富.梁子湖区域内各个小湖π值为3.13×10-6～2.3×10-5,表明小湖内不同居群仍存有较大遗传差异.北部地区不同湖泊野莲 π值变幅为3.05×10-6～1.50×10-5,山东梁山古代莲多样性最为丰富.长江中下游地区野莲遗传多样性高于北部地区且两者间分化程度较高(FST=0.34),表明野莲居群间和区域间均有较高的分化程度,原因可能是野莲居群内主要为克隆繁殖,而居群间基因交流少所致.

为探究苗药八爪金龙群体遗传进化和亲缘关系的远近,该研究利用简化基因组测序技术(SLAF-seq)对42份八爪金龙样品进行测序,获得多态性SLAF标签.同时采用GATK和SAMtools软件在多态性SLAF中检测单核苷酸多态性(SNP)分子标记,并利用SNP分子标记分析八爪金龙样品间的遗传分化关系.结果表明:(1)42份八爪金龙共获得246.35 Mb reads,测序质量值Q30的平均值为95.66％,GC含量的平均值为41.14％.(2)通过生物信息学的分析,获得1769265个SLAF标签,其中379829个多态性SLAF标签,共开发2299640个SNPs分子标记.(3)利用开发的SNPs数据构建八爪金龙的系统发育树,42份八爪金龙分成两个大的类群.第一类群为细柄百两和原变种百两金;第二类群由贵州朱砂根、红凉伞、湖北朱砂根和江西朱砂根组成.江西朱砂根与其余群体关系较远,有明显的分群现象.该研究从基因组水平揭示不同地区八爪金龙资源之间的遗传关系,为八爪金龙种质资源的鉴定和遗传多样性分析提供了理论基础,所开发的SNP位点可进一步用于挖掘与品质、抗逆性等相关的基因.