目的:探讨miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞(hDPSCs)成牙本质分化的影响及信号通路调控机制.方法:对hDPSCs转染miR-20a-3p-mimic和miR-20a-3p-inhibitor来上调或下调其表达,然后对hDPSCs进行成牙本质分化诱导培养.通过茜素红染色观察细胞钙基质的矿化程度并检测ALP活性.通过双荧光素酶报告基因测定实验验证miR-20a-3p与mothers against decapentaplegic homolog(SMAD)特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMURF1)的靶向调节关系.通过RT-qPCR检测hDPSCs中miR-20a-3p以及SMURF1、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙蛋白(OCN)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA水平.结果:与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的茜素红相对染色强度升高了67.09％,miR-20a-3p-inhibitor组降低了46.13％(P＜0.05).与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的相对ALP活性升高了52.89％,miR-20a-3p-inhibitor组降低了53.32％(P＜0.05).与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的RUNX2、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别升高了 2.19倍、1.86倍和2.35倍,miR-20a-3p-inhibitor组分别降低了63.26％、58.84％和68.12％(P＜0.05).双荧光素酶报告基因测定显示miR-20a-3p靶向抑制SMURF1(P＜0.05).过表达SMURF1抑制了 miR-20a-3p对成牙本质分化的影响(P＜0.05).结论:miR-20a-3p通过靶向抑制SMURF1及其下游基因促进hDPSCs的成牙本质分化.

目的 探究小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,BMP-2/Smad信号通路与Wnt/β-catenin通路的串话机制.方法 将预先准备好的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)质粒转染至C3H10T1/2细胞,利用G418抗药性筛查转染成功的细胞.将实验细胞分为转染组、空白组.通过ELISA检测各组细胞上清液中的BMP-2含量,采用Western blot和RT-PCR方法检测两组中Smad泛素化调节因子2(Smurf2)、β-链蛋白(β-catenin)、磷酸化β-链蛋白(pβ-catenin)、转录因子RUNX2、淋巴增强因子1(LEF1)、Axin2、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)等关键细胞因子的表达水平.结果 与空白组比较,转染组BMP-2浓度升高并维持在较高水平(P<0.05),β-catenin mRNA的表达上调(P<0.05)和磷酸化水平增加(P<0.01),LEF1蛋白合成上调(P<0.05),Smurf2蛋白表达减少(P<0.05),RUNX2的mRMA表达上调(P<0.01).结论 在成骨细胞分化过程中,BMP-2/Smad信号通路与Wnt/β-catenin通路存在串话机制,增加β-catenin的表达水平,促进β-catenin的磷酸化.

泛素-蛋白酶体系统是维持细胞内蛋白质稳态和功能的重要调节途径,泛素化参与调节细胞的增生、分化和存活,泛素化调节异常可导致代谢性骨病、肿瘤等疾病的发生.越来越多的证据表明泛素-蛋白酶体系统参与调控成骨细胞功能和骨形成.泛素连接酶(E3 ubiquitin ligases,E3)作为泛素和底物蛋白之间的衔接分子可特异性识别底物,在骨形成相关蛋白调节和骨转换过程中具有重要的意义.既往研究表明E3连接酶通过介导酪氨酸激酶受体、信号蛋白和转录因子等参与成骨细胞增生、分化、存活和骨形成的调节.Smurf1、Cbl和SCFβ-TrCP等E3连接酶可特异性介导Runx2、MEKK2、JunB、β-catenin、Gli2、ATF4等成骨细胞分化重要调节蛋白的降解,抑制成骨功能.E3连接酶作为促进骨形成和减少骨丢失理想的治疗靶标,具有广阔的研究前景.本文对E3连接酶在骨形成调节中的作用及机制进行回顾和总结.

目的 探究大鼠孕期尼古丁暴露对子代成骨细胞(OB)BMP-4/Smad信号通路的影响.方法 将妊娠期大鼠分为对照组与实验组,对照组受孕第9天皮下注射2mg/(kg·d)生理盐水,实验组在受孕后第9天于皮下注射2mg/(kg·d)尼古丁,新生3天乳鼠处死后收集颅骨,采用钙钴法对OB碱性磷酸酶进行染色,反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)测定OB细胞中骨形态发生蛋白4(BMP-4)、Smad1、Smad5、Smad8、Runt相关转录因子2(Runx-2)、成骨相关转录因子(Osterix)、Smads泛素化调节因子1(Smurf1)表达,免疫印迹法(Western blot)检测OB中BMP-4、Smad1、Smad5、Smad8、Runx-2、Osterix、Smurf1蛋白表达.结果 ALP染色显示OB细胞胞体较大,细胞核染色呈蓝紫色,细胞质呈淡紫色,对照组ALP细胞阳性率为42.69％±5.16％,高于实验组(18.67％±3.19％),差异有统计学意义(P<0.05).RT-PCR结果显示实验组BMP-4、Smad1、Smad5、Smad8、Runx-2、Osterix mRNA表达量均低于对照组,Smurf1mRNA表达量高于对照组,差异有统计学意意义(P<0.05).West-ern blot法检测结果显示,实验组乳鼠OB中BMP-4、Smad1、Smad5、Smad8、Runx-2、Osterix蛋白表达量均低于对照组,Smurf1蛋白表达量高于对照组.蛋白条带灰度扫描结果显示,实验组乳鼠OB中BMP-4、Smad1、Smad5、Smad8、Runx-2、Osterix蛋白相对灰度值均低于实验组,Smurf1蛋白相对灰度值高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 大鼠孕期尼古丁暴露对OB具有一定的抑制作用,可能与上调Smurf1表达、抑制BMP-4/Smad信号通路和下调转录因子Runx-2、Osterix有关.

目的 褪黑素能否挽救糖皮质激素所导致的成骨分化障碍尚不明确.文中旨在探讨褪黑素对糖皮质激素所致成骨分化障碍的抑制作用.方法 应用地塞米松和褪黑素处理前成骨细胞系MC3T3-E1.将MC3T3-E1细胞分为对照组(基础培养液)、骨诱导组(骨分化细胞培养基)、地塞米松组(骨分化细胞培养基+100μmol/L地塞米松)、褪黑素组(骨分化细胞培养基+100μmol/L地塞米松+1μmol/L褪黑素);信号通路组(骨分化细胞培养基+100μmol/L地塞米松+1μmol/L褪黑素+1μmol/L LDN193189)与泛素化酶组(骨分化细胞培养基+100μmol/L地塞米松+1μmol/L褪黑素+5μmol/L MG132).通过碱性磷酸酶(ALP)活性检测及染色、茜素红S染色及定量分析、qRT-PCR、Western blot评估细胞成骨分化和矿化.进一步分析BMP/Smad信号通路抑制剂(LDN193189)及泛素化酶抑制剂MG132对Runx2的影响.结果 MC3T3-E1细胞中ALP、OCN、COLL-1、Runx2 mRNA的表达水平比较,褪黑素组较地塞米松组明显升高(P<0.05),地塞米松组、对照组较骨诱导组明显降低(P<0.05).与对照组、地塞米松组比较,骨诱导组可以显著提升ALP酶活性、茜素红染色定量表达、Runx2蛋白表达(P<0.05);与地塞米松组比较,褪黑素组显著增加了ALP酶活性、茜素红染色定量表达、Runx2蛋白含量(P<0.05).与褪黑素组比较,信号通路组显著降低了Runx2蛋白含量(P<0.05),泛素化酶组Runx2蛋白含量表达亦显著降低(P<0.05),同时伴随着Smurf2表达显著增高(P<0.05).结论 褪黑素通过BMP/Smad信号通路,缓解了地塞米松导致的MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制,同时伴随着由Smurf2介导的泛素化途径参与.