目的:通过在单细胞水平分析小鼠磨牙细胞间异质性，构建牙髓细胞发育的时空图谱，进一步揭示牙齿发育的过程和调控机制。方法:分别收集出生后0、3 d的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙各10颗，制备单细胞悬液，采用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术进行测序。从本课题组前期研究中提取出生后7 d小鼠磨牙scRNA-seq数据，与0、3 d数据进行合并分析。使用Seurat程序对测序数据进行质控、标准化、降维和聚类分析；Monocle程序进行拟时序分析，预测发育轨迹；Scillus程序进行基因本体分析，对细胞功能进行注释。使用原位杂交技术对标记基因进行体内定位，明确不同亚群细胞的体内分布和时空变化。结果:Seurat分析显示小鼠磨牙细胞具有26个细胞亚群，可分为牙髓细胞、牙囊细胞、上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞、管周细胞、胶质细胞和红细胞等八大类细胞，其中牙髓细胞包含5个亚群：成熟牙髓细胞，标记基因为柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackie virus and adenovirus receptor，Cxadr）；牙乳头细胞，标记基因为SPARC相关模块化钙结合蛋白2（SPARC related modular calcium binding 2，Smoc2）；周期细胞，标记基因为Ⅱ型DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase Ⅱ alpha，Top2a）；前成牙本质细胞，标记基因为棕榈酰蛋白羧酸酯酶（notum palmitoleoyl-protein carboxylesterase，Notum）；成牙本质细胞，标记基因为牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，Dspp）。随着牙胚发育，成熟牙髓细胞的比例逐渐增加，周期细胞和成牙本质细胞比例逐渐降低。原位杂交染色和基因本体分析结果显示，Cxadr+成熟牙髓细胞定位于牙冠上部，主要功能为成骨和“细胞外结构组织”；Smoc2+牙乳头细胞位于根尖，主要功能与“细胞外结构组织”和器官发育相关；Top2a+周期细胞位于牙冠下部，进行有丝分裂；Notum+前成牙本质细胞邻近上皮根鞘，和Dspp+成牙本质细胞的主要功能同为生物矿化。Monocle分析显示牙髓细胞有2条发育轨迹，从Smoc2+牙乳头细胞起始，经过Top2a+周期细胞，再分化为Cxadr+成熟牙髓细胞或成牙本质细胞。结论:scRNA-seq技术能在转录组水平充分揭示细胞间的异质性，为研究器官发育过程和调控机制提供了有力工具。

牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）是牙髓及牙本质再生研究中关键的优选细胞，具有多向分化的能力。微量元素对DPSC分化的影响是近年口腔组织工程的研究热点。微量元素具有广泛的生理生化功能，一方面可直接调控DPSC分化、迁移和增殖能力；另一方面可通过发挥抗菌及免疫调节作用以及改变支架材料的理化特性，间接影响DPSC分化。明确微量元素在DPSC分化中的作用可为实现牙髓及牙本质再生提供更多的参考依据，本文就近年国内外关于微量元素对DPSC成牙向和成血管向分化的作用及机制研究进行综述。

目的:通过筛选能成功诱导人牙髓细胞（human dental pulp cell，HDPC）向成牙本质细胞样细胞分化的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的有效浓度，探讨体内诱导HDPC进行牙本质再生的ATP适宜浓度。方法:用0（对照组）、10、400、600、800 μmol/L ATP处理HDPC后，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）和蛋白质印迹法分别检测HDPC增殖以及成牙本质分化相关基因和蛋白[牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）]的表达；用茜素红染色评估诱导21 d后矿化结节情况（各组样本量均为5），并溶解矿化结节后定量分析各组溶液吸光度值（ A值）。筛选既能有效诱导HDPC成牙本质向分化，又能降低ATP对HDPC增殖抑制作用的浓度作为ATP的适宜浓度，并选用此浓度进行动物体内实验。HDPC经此浓度ATP预处理7 d后接种于明胶海绵上，并置入6~7 mm长、管径1.0~2.5 mm的人牙根管片段内（ATP处理组，样本量为8）；非ATP处理组的明胶海绵接种未经ATP预处理的HDPC（样本量为8），空白对照组的明胶海绵未接种细胞（样本量为2）。各组根管片段移植于免疫缺陷鼠（9只）背部双侧皮下，3个月后取材进行HE染色和组织学观察。 结果:培养5 d时与对照组相比，10 μmol/L ATP组HDPC增殖显著增加（ P<0.05），而600和800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著减小（ P<0.05），且800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著小于600 μmol/L ATP组（ P<0.05）。与对照组相比，600和800 μmol/L ATP组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均显著上调（ P<0.05），且两组间差异无统计学意义（ P>0.05），而其他各组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均无显著上调（ P>0.05）。诱导21 d后600和800 μmol/L ATP组均可见明显的矿化结节，其他组均未见矿化结节；定量分析显示0、10、400、600、800 μmol/L ATP组 A值分别为1.05±0.15、1.11±0.23、1.15±0.17、3.65±0.30、3.40±0.43，600与800 μmol/L ATP组 A值均显著大于其他各组（ P<0.05），且600与800 μmol/L ATP组间差异无统计学意义（ P>0.05）。HE染色结果显示，600 μmol/L ATP可诱导HDPC在根管牙段内分化形成牙本质样结构。 结论:600 μmol/L为ATP诱导HDPC成牙本质向分化的适宜浓度，该浓度ATP可在免疫缺陷小鼠体内诱导HDPC形成牙本质样结构。

目的:探究转录因子激活蛋白2家族的成员转录因子激活蛋白2C（TFAP2C）在小鼠磨牙牙胚发育过程中的表达及其影响。方法:实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）分析胚胎（E）14.5小鼠胚胎各器官及E12.5~E18.5和出生后0~7天的小鼠磨牙牙胚内Tfap2c的相对表达水平，冰冻切片免疫荧光染色显示Tfap2c在小鼠磨牙牙胚内的表达位置。采用牙胚体外培养的方法，探究敲降Tfap2c对小鼠磨牙牙胚发育的影响，RT-qPCR检测成牙本质细胞表达相关基因的相对表达水平。分离并提取小鼠牙胚间充质细胞进行培养，探究敲降Tfap2c对小鼠牙胚间充质细胞的影响，划痕愈合实验检测细胞迁移，细胞计数（CCK-8）法检测细胞增殖。结果:Tfap2c基因在小鼠磨牙牙胚发育早期相对表达水平较高。E13.5，Tfap2c在小鼠磨牙牙胚上皮组织与间充质组织内均有表达，二者的相对表达水平差异无统计学意义（ t=1.06， P=0.472）。E14.5，Tfap2c在小鼠磨牙牙胚初级釉结附近的间充质组织内表达，小鼠磨牙牙胚间充质组织内Tfap2c的相对表达水平（1.000±0.036）显著高于上皮组织（0.199±0.008）（ t=37.29， P<0.001）。体外培养小鼠磨牙牙胚并敲降Tfap2c后，小鼠磨牙牙胚牙尖相对高度（0.708±0.171）及牙尖高度与牙冠高度的比值（0.321±0.068）均显著低于对照组（分别为1.000±0.287和0.483±0.166）（ t=2.79， P=0.012； t=2.85， P=0.015）；对照组的牙冠相对高度（1.078±0.206）及相对宽度（1.000±0.116）与敲降组的差异均无统计学意义（分别为0.993±0.254和0.999±0.122）（ t=0.83， P=0.419； t=0.01， P=0.992）。体外培养小鼠磨牙牙胚内敲降Tfap2c，成牙本质细胞表达相关基因Dspp和Dmp1相对表达水平均显著低于对照组（ t=15.33， P<0.001； t=13.81， P<0.001）。在小鼠牙胚间充质细胞内敲降Tfap2c，划痕愈合实验显示，对照组细胞48 h划痕宽度显著小于敲降组（ t=29.86， P=0.001）；CCK-8法检测显示对照组与敲降组细胞间各时间点吸光度值的差异均无统计学意义（ P>0.05）；Tfap2c敲降组牙胚间充质细胞内成牙本质细胞表达相关基因Dspp和Dmp1相对表达水平均显著低于对照组（ t=3.86， P=0.031； t=4.36， P=0.022）。 结论:Tfap2c在小鼠磨牙牙胚发育早期表达，主要表达于小鼠磨牙牙胚间充质组织内，敲降Tfap2c影响小鼠磨牙牙胚牙尖形成，影响牙胚间充质细胞迁移。

目的:探讨miR-615-3p及其靶基因纤维蛋白 1(FBLN1)在脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化中的作用及其相互调控机制.方法:利用慢病毒转染ADSCs分别敲低miR-615-3p及过表达FBLN1,Western blot和实时荧光定量PCR检测miR-615-3p敲低效率和FBLN1 过表达效率以及敲低miR-615-3p后FBLN1 的表达,通过碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色检测敲低miR-615-3p和过表达FBLN1 对ADSCs的成骨分化能力的影响,通过实时荧光定量PCR检测敲低miR-615-3p和过表达FBLN1 ADSCs成骨细胞特异性转录因子 Osterix(OSX)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白-1(DMP1)的基因表达,通过Western blot检测敲低miR-615-3p和过表达FBLN1 后ADSCs DMP1 和DSPP蛋白表达.结果:敲低ADSCs中miR-615-3p后,miR-615-3p基因表达降低,ALP活性升高(P＜0.05),矿化结节增多,OSX、DMP1、DSPP 基因表达水平上升(P＜0.05),DMP1、DSPP蛋白表达升高.低表达miR-615-3p的ADSCs中FBLN1 表达升高.过表达FBLN1 后,ADSCs中FBLN1 蛋白和基因表达升高,ALP活性升高(P＜0.05),矿化结节增多,OSX、DMP1、DSPP基因表达水平上升(P＜0.05),DMP1、DSPP 蛋白表达升高.结论:miR-615-3p通过下调FBLN1 抑制ADSCs的成骨分化.

本文将简要论述牙髓干细胞等牙源性干细胞对牙髓牙本质复合体再生的作用,以及细胞外基质蛋白、细胞外信号分子和生物支架材料等在其中可能的调控作用,以期促进干细胞或干细胞衍生物介导的牙髓牙本质复合体修复再生.

背景:甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl,Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率,这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法.目的:探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响.方法:将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中,采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力.将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导,采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况,采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达.结果与结论:①CCK-8检测结果显示,前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高,第10天时速度减缓;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05);③RT-PCR结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05),且14 d基因表达量明显高于7 d(P<0.05).结果表明,培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力,能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力.

目的:探究促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对大鼠牙髓损伤后修复性牙本质形成的作用.方法:分离并鉴定人牙髓细胞(Dental pulp cells,DPCs),将DPCs分为对照(control)组、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)组、TNF-α+EPO组;使用CCK-8法、Transwell法、碱性磷酸酶染色和茜素红染色法检测细胞增殖、迁移、成骨分化能力.将30只大鼠随机分为磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline,PBS)组、氢氧化钙[Ca(OH)2]组和EPO组,对大鼠上颌第一磨牙进行牙髓暴露,分别以含PBS、Ca(OH)2和EPO的胶原蛋白海绵盖髓;术后1个月处死大鼠,micro-CT和苏木精-伊红染色观察修复性牙本质形成;免疫组化染色和Western blot检测牙本质基质蛋白-1(Dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)、Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、Osterix(Osx)水平.结果:与control组相比,TNF-α组DPCs增殖、迁移、成骨分化能力降低(P＜0.05);与TNF-α组相比,TNF-α+EPO组DPCs增殖、迁移、成骨分化能力提高(P＜0.05).与PBS组、Ca(OH)2组相比,EPO组露髓处形成连续完整的钙化桥及大量修复性牙本质,DMP-1、DSPP、Runx2、Osx水平升高(P＜0.05).结论:EPO通过提高DMP-1、DSPP、Runx2、Osx水平促进牙髓损伤大鼠修复性牙本质形成.

硬组织发育是生物机体发育过程中的重要组成部分,小整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白家族在硬组织发育过程中发挥重要的调控作用,如:促进干细胞的成牙本质分化或成骨分化,调控成牙本质细胞或成骨细胞的基因表达等.编码小整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白家族的基因发生突变可引起硬组织矿化异常,导致如低血磷性佝偻病、牙本质发育不全等多种疾病.近年来,学者们对该蛋白家族在硬组织发育中的调控作用开展了深入研究,揭示了该蛋白家族的主要分子调控机制,加深了对其作用及机制的认知.因此,本文对小整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白家族在生物硬组织发育中的调控作用及其机制的研究进展进行总结和综述.

牙髓再生是一种基于组织工程治疗牙髓坏死的新策略,应用种子细胞结合支架和生长因子,实现牙本质、血管和神经的新生.外泌体是一类直径约为30～150 nm的细胞外囊泡,在调控细胞间信息和物质传递中发挥重要作用.2016年以来,牙源性间充质干细胞分泌的外泌体因其在牙髓组织再生领域展现出的巨大潜力而备受瞩目.本文介绍了牙源性间充质干细胞来源外泌体的种类和培养环境,并对牙源性间充质干细胞外泌体调控细胞成牙本质向分化、血管生成、神经再生和成骨向分化的作用和机制作一综述.