目的:鉴定SseK3蛋白宿主中新的生物学底物以及对其功能的影响。方法:通过酵母双杂交系统(yeast-two-hybrid，Y2H)从HeLa cDNA文库中筛选SseK3潜在结合蛋白；通过细胞共表达和体外活性试验检测SseK3对底物蛋白的精氨酸N-乙酰葡萄糖胺化(Arg-GlcNAc)修饰；通过点突变检测SseK3对底物蛋白的修饰位点；通过免疫共沉淀试验检测底物蛋白的Arg-GlcNAc修饰对其互作蛋白结合能力的影响。结果:酵母双杂交和基因测序结果表明，SseK3的一个全新底物是Snapin；SseK3在细胞内和体外均可以Arg-GlcNAc修饰Snapin；修饰位点位于Snapin蛋白C端的119和120位精氨酸；Arg-GlcNAc修饰Snapin抑制了Snapin-SNAP25的结合。结论:本研究成功筛选到SseK3的一个新的宿主底物蛋白Snapin，初步研究了SseK3对Snapin的Arg-GlcNAc修饰及该修饰对Snapin功能的影响，为后续进一步理解细菌的Arg-GlcNAc修饰功能以及在病原微生物感染过程中的作用机制提供理论依据。

目的 研究鼠伤寒沙门菌Ssek3基因的序列结构特征及蛋白表达纯化.方法 从鼠伤寒沙门菌SL1344株获得Ssek3基因的序列,利用生物信息学方法进行系统性分析,并进行原核表达及纯化.结果 软件预测分析结果显示,SseK3蛋白由335个氨基酸,72个氨基酸残基组成,蛋白质理论相对分子质量(Mr)为37.89×103,分子式为C1700 H2629 N463O497S12,等电点为6.7,属于稳定存在的亲水蛋白质.该蛋白质无信号肽也无跨膜区,属于膜内蛋白,含有5个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、33个磷酸化位点、22个B细胞线性结合位点和11个T细胞结合位点以及21个二硫键位点.二级结构中,α-螺旋(Hh)占34.03％(114个),伸展链(Ee)占21.49％(72个),β-折叠(Tt)占8.96％(30个),无规则卷曲(Cc)占35.52％(119个).实验结果显示,Ssek3基因大小为1008 bp,SDS-PAGE分析显示,Ssek3基因在原核表达系统中以分泌蛋白形式存在,表达的融合蛋白大小(Mr)约为40×103.结论 本研究成功克隆了鼠伤寒沙门菌Ssek3基因,对其进行序列分析和原核表达,为深入探究Ssek3蛋白在鼠伤寒沙门菌感染宿主细胞中的作用提供资料.

目的 检测sseK2基因的缺失对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,为探究该基因的功能及开发安全有效的鼠伤寒沙门菌活疫苗提供新思路.方法 首先通过重组自杀性质粒介导,两步筛选法敲除1047 bp sseK2基因并成功构建缺失株及其回复株,进而检测其生物学和免疫学特性.结果 PCR、双酶切及测序结果分析,证实构建了SL1344△sseK2缺失株及其回复株.生物学特性研究表明,缺失株SL1344△sseK2保留了亲本株SL1344的血清型1,4,[5],12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK2基因,生化特性和生长速度并未发生明显改变,但与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变.缺失株SL1344△sseK2口服感染6周龄BALB/c小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD50)为3.44×108菌落形成单位(colony-forming units,CFU),毒力较亲本株SL1344降低了1620倍.免疫保护效力试验显示,缺失株免疫17 d后对鼠伤寒沙门菌野生株攻毒小鼠的保护率为62.5％,小鼠免疫14 d后血清抗体IgG达到最高.回复株与亲本株生物学特性无显著性差异,基本回复到野生型水平.结论 成功构建了SL1344△sseK2基因缺失株,其遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,推测sseK2对SL1344的毒力具有重要的调节作用,为探究该基因的功能及评估其作为用于减毒活疫苗的候选株提供参考.

目的:检测sseK3基因的缺失对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,为探究该基因的功能及开发安全有效的鼠伤寒沙门菌活疫苗提供了新思路.方法:通过重组自杀性质粒介导,两步筛选法敲除sseK3基因并成功构建缺失菌株的回复菌株,进而检测其生物学和免疫学特性.结果:PCR、双酶切及测序结果证实成功构建了sseK3缺失株及其回复菌株.生物学特性研究表明,sseK3缺失菌株和亲本株SL1344血清型均为1,4,5,12:i:1,2,生化特性和生长速度无明显差异,且sseK3缺失株能够稳定遗传;sseK3缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为2.96×108 CFU,与亲本菌株SL1344相比,sseK3缺失株的LD50值升高约1035倍,毒力显著下降;免疫保护效力实验显示:sseK3缺失株免疫后第17天保护率为66.7％;在免疫小鼠后的第14天血清IgG达到最高水平;回复菌株与亲本亲株生物学特性无显著性差异,基本回复到野生型水平.结论:成功构建了鼠伤寒沙门菌sseK3基因缺失株,可稳定遗传,毒力显著降低,具有良好的免疫原性,推测sseK3对鼠伤寒沙门菌的毒力具有重要的调节作用,为探究该基因的功能及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础.

目的:研究鼠伤寒沙门菌SseK1蛋白免疫生物学特性及其作为潜在免疫抗原蛋白的可能性.方法:利用PCR方法从鼠伤寒沙门菌SL1344株克隆获得sseK1基因片段,测序分析正确后连接至原核表达载体pET-32a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中诱导表达.Western blot进一步检测镍离子亲和层析法纯化的SseK1蛋白并进行免疫生物学特性分析.结果:PCR及测序结果表明BL21(pET-32a-SseK1)构建成功.经SDS-PAGE分析显示,表达的SseK1蛋白大小约为43 kD,在原核表达反应器中主要以可溶性形式存在于菌体裂解上清中;经Western blot分析显示,SseK1蛋白可被鼠伤寒沙门菌阳性多抗血清识别,具有良好的反应原性;用SseK1蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,二免后21 d间接ELISA检测的抗体效价高达1:124000,具有良好的免疫原性.淋巴细胞增殖试验结果表明SseK1能够显著刺激小鼠T淋巴细胞增殖,激发机体细胞免疫应答,差异具有统计学意义(P<0.05).小鼠攻毒及免疫保护试验表明,鼠伤寒沙门菌强毒株对二免14 d后的小鼠攻毒显示60％以上的免疫保护力.结论:本研究表达的SseK1蛋白具有良好的抗原性,为深入研究鼠伤寒沙门菌与机体在感染和免疫方面的相互作用奠定了一定的理论基础.