目的:鉴定SseK3蛋白宿主中新的生物学底物以及对其功能的影响。方法:通过酵母双杂交系统(yeast-two-hybrid，Y2H)从HeLa cDNA文库中筛选SseK3潜在结合蛋白；通过细胞共表达和体外活性试验检测SseK3对底物蛋白的精氨酸N-乙酰葡萄糖胺化(Arg-GlcNAc)修饰；通过点突变检测SseK3对底物蛋白的修饰位点；通过免疫共沉淀试验检测底物蛋白的Arg-GlcNAc修饰对其互作蛋白结合能力的影响。结果:酵母双杂交和基因测序结果表明，SseK3的一个全新底物是Snapin；SseK3在细胞内和体外均可以Arg-GlcNAc修饰Snapin；修饰位点位于Snapin蛋白C端的119和120位精氨酸；Arg-GlcNAc修饰Snapin抑制了Snapin-SNAP25的结合。结论:本研究成功筛选到SseK3的一个新的宿主底物蛋白Snapin，初步研究了SseK3对Snapin的Arg-GlcNAc修饰及该修饰对Snapin功能的影响，为后续进一步理解细菌的Arg-GlcNAc修饰功能以及在病原微生物感染过程中的作用机制提供理论依据。

本研究从溶藻弧菌中成功克隆获得Va1686基因的编码区序列(GenBank:KX245316),该基因全长1 164bp,可编码387个氨基酸,应用生物信息学的方法和工具对溶藻弧菌HY9901Ⅲ型分泌系统效应蛋白Va1686的理化性质、蛋白结构、遗传进化关系和抗原特性等方面进行预测和分析.结果表明:Va1686蛋白为稳定的亲水性蛋白,蛋白呈酸性,不具有跨膜区和信号肽,二级结构以α螺旋为主.进化分析显示溶藻弧菌HY9901与哈维氏弧菌(V.harveyi)聚为一支,表明在进化关系上最为接近.Va1686蛋白包含一段与细胞分裂相关的Fic superfamily保守结构域.生物信息学分析表明Va1686可能的B细胞抗原优势表位,分别是第48～49、82～85、125～126、150～153、185～186、236～237等区段.利用SWISS-MODEL软件,模拟了Va1686亚基三维结构模型,发现与其同源蛋白副溶血弧菌vopS非常相似,相似度达到89.46％.本研究从生物信息学角度分析了Va1686作为弧菌共同抗原的可行性,为下一步的疫苗研发提供了理论依据.

目的:回顾和整理近20年针灸治疗卵巢早衰(POF)的研究成果与作用机制,为临床针灸治疗POF提供参考依据.方法:通过计算机检索PubMed、中国期刊全文数据库(CNKI)、维普中文科技期刊数据库(VIP),收集整理自1998年1月1日至2017年3月31日针灸治疗POF的文献,从选穴规律、治疗方法等方面归纳分析,阐述潜在的作用机制.结果:最终获得针灸治疗POF的临床文献26篇,阐释作用机制的实验类文献5篇.临床治疗卵巢早衰的辨证分型及使用频次前3位的腧穴分别为少阴病证(太溪、三阴交、关元穴),太阴病证(三阴交、足三里、次髎穴),厥阴病证(太冲、神庭、关元穴),少阴、厥阴兼证(三阴交、肝俞、肾俞穴),少阴、太阴兼证(脾俞、三阴交、足三里穴),冲任失调(关元、子宫、肓俞穴).十四经经脉腧穴使用频率前5位的穴位由高到低依次为关元、肾俞、三阴交、中极、脾俞、太溪、肝俞.经外奇穴则以局部取穴为主.按经脉腧穴使用个数排序前5位的经脉由高到低依次为:足太阳膀胱经、督脉、任脉、足太阴脾经、足少阴肾经.选穴部位多分布在胸腹部、腰背部及下肢.临床方法多样,包含毫针刺、电针疗法、灸法、穴位埋线疗法等.其机制可能是:通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴(HPOA)的功能,恢复性激素正常水平;改善卵巢、子宫的组织学形态;影响神经-内分泌-免疫调控系统,提高机体免疫力;调节卵巢早衰相关信号通路的基因和蛋白表达水平等,达到治疗效果.结论:虽然针灸治疗卵巢早衰在临床上已取得一定疗效,但其作用机制的研究却有限.从机制上阐明针灸治疗POF,可以指导临床实践.今后应规范临床路径,探究效应机制,通过设计科学严谨的实验,选取更为客观合理的评价体系,进行深入系统地研究.

本研究从溶藻弧菌中成功克隆获得HY322基因的编码区序列(GenBank:KX245317.1),该基因全长969 bp,可编码322个氨基酸,应用生物信息学的方法和工具对溶藻弧菌HY9901效应蛋白HY322的理化性质、蛋白结构、遗传进化关系和抗原特性等方面进行预测和分析.结果表明:HY322蛋白为不稳定的亲水性蛋白,蛋白呈酸性,无跨膜区,无明显的信号肽;二级结构以α螺旋为主,进化分析显示溶藻弧菌HY9901与哈维氏弧菌(V.harveyi)聚为一支,表明在进化关系上最为接近.HY322序列中包含有一个与鞭毛形成有关的FliN功能结构域.多种参数预测了HY322可能的B细胞抗原优势表位,分别是第32～33、100～102、138～140、215～216、235～238、246～249区段.利用SWISS-MODEL软件,得到了HY322亚基三维模型.本研究从生物信息学角度验证了HY322作为弧菌共同抗原的可行性,为下一步的疫苗研发提供了理论依据.

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能够通过Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion systems,T3SSs)分泌效应蛋白VopS,催化三磷酸腺苷(ATP)分子中的单磷酸腺苷(AMP)通过磷酸二酯键共价连接至宿主细胞Rho鸟苷三磷酸激酶(Rho GTPases)成员蛋白RhoA、Rac1和Cdc42的特定的苏氨酸残基上,导致宿主细胞肌动蛋白骨架崩解,细胞变圆.该发现推动了一种蛋白质翻译后修饰方式——单磷酸腺苷酸化(AMPylation)修饰的迅速发展,其中催化AMPylation修饰的蛋白质称为单磷酸腺苷酸化酶(AMPylator).目前的研究表明,与蛋白质的磷酸化修饰类似,蛋白质AMPylation在真核以及原核生物中都是一种重要的调控蛋白质功能的翻译后共价修饰调节机制.与AMPylation相对应的是去单磷酸腺苷酸化(de-AMPylation),即去单磷酸腺苷酸化酶(de-AMPylase)催化修饰后的蛋白质脱去AMP基团的过程,使底物蛋白重新恢复其原有的生物学功能.现就蛋白质AMPylation修饰的催化过程、AMPylation修饰的研究进展以及AMPylator/de-AMPylase的种类、物种来源、结构、功能和底物等方面的内容进行综合阐述.此外,就目前已有的AMPylation检测方法进行了总结,其中详细阐述了一种化学标记法的原理和过程.

病原菌感染时人类健康构成了严重的威胁,一类具有三型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)的致病菌,可以通过T3SS将效应蛋白“注射”到宿主细胞中,去干扰宿主细胞的多种信号转导通路,从而促进病原菌的增殖和传播.T3SS效应蛋白对宿主的影响被广泛研究,并且不同病原菌采取相似或不同的策略,同一种病原菌的效应蛋白又具有协同或拮抗的功能.综述了T3SS效应蛋白参与宿主细胞凋亡和焦亡信号通路过程中所发挥的功能及分子机制的最新研究进展,并进行了归纳分析,旨在为T3SS效应蛋白的深入研究提供参考和思路,从而进一步推进病原菌致病机制的研究,为防治病原菌提供理论基础.

乳头状胶质神经元肿瘤(PGNT)是独立的实体肿瘤,肉眼观察为囊实性瘤体,偶有实性表现,偶见瘤内钙化;组织病理学特征比较明显,呈乳头状结构,由单层扁平状和假复层小立方体状的胶质细胞构成;免疫表型特征为GFAP的强阳性表达,可以与突触囊蛋白、神经元特异性烯醇化酶等神经元分泌物特异性标记、结合,在电镜下可以发现含有胶质细胞丝的细胞、含有长的突起和真性突触的细胞及具有低分化特征的三种特征性细胞,而在分子遗传学方面发现PGNT存在一个含PRKCA的融合基因与特定的Fc甲基化蛋白保持恒定的一致性.PGNT影像学方面也具有很多特征性表现,其多位于幕上深部脑室旁白质区域,多发部位为额叶和颞叶,多伴钙化,偶可见瘤体内出血,因发生多接近侧脑室,故推测其起源是多能性室管膜下干细胞,常与室管膜肿瘤、脉络丛癌、少突胶质细胞瘤、高级别星形细胞瘤等进行影像学鉴别.PGNT的生物学特征一般多表现为惰性,生长速度慢,占位效应明显,而一般不存在浸润、侵犯、转移等恶性行为,但有时也存在形态学上不典型性或者恶向转变的特征.

[目的]探究花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MM6的Ⅲ型分泌系统(T3SS)的结构及其在根瘤菌与不同宿主建立共生关系中的作用.[方法]同源比对分析菌株MM6的T3SS基因簇的结构特征,并采用三亲本接合转移的方法构建T3SS调节基因ttsI突变菌株;通过蛭石结瘤和石蜡切片实验,比较突变体与野生型的共生固氮表型差异.[结果]经预测,MM6的T3SS基因簇编码区长约34.1 kb,可分为3个区域,包含10个保守结构基因和8个效应蛋白基因,与B.diazoefficiens USDA 110相应基因的序列相似性为83％-93％;成功构建了MM6的ttsI突变株;ttsI突变株与野生型分别与花生(S523和Y45)、野大豆和大豆中黄57结瘤,ttsI突变体在花生中的总瘤数显著增加(P＜0.05),根瘤中含菌细胞更多;ttsI突变体在野大豆中平均每株植物增加4个根瘤,根瘤中含菌细胞更多,地上部干重相比野生型MM6显著增加(P＜0.05);在大豆中黄57中,野生型MM6能形成红色的有效根瘤,ttsI突变体不结瘤,且植株叶片发黄,地上部干重相比野生型MM6显著降低(P＜0.05).[结论]MM6的T3SS在花生和野大豆共生体系中起着有害的作用,而在大豆中黄57的共生体系中起着有利的作用.

作为活体营养专性寄生真菌,条形柄锈菌(小麦条锈病)在侵染过程中通过形成吸器向寄主细胞释放效应蛋白,干扰寄主的防卫反应,促进其侵染与致病.因此,条形柄锈菌效应蛋白的鉴定与功能研究对揭示其毒性机理具有重要意义.本实验室前期完成了条形柄锈菌CYR31生理小种吸器转录组分析,从中鉴定得到一个吸器特异诱导表达分泌蛋白Hasp68,利用农杆菌侵染在烟草细胞中瞬时表达该基因,能够抑制小鼠促细胞凋亡蛋白Bax诱导的细胞程序性死亡,鉴定为条形柄锈菌候选效应蛋白.Hasp68基因全长318bp,编码105_aa,N-端包含20_aa的信号肽,无保守结构域.BlastX分析表明Hasp68为条形柄锈菌特有效应蛋白,在其他真菌中无同源蛋白,且在条形柄锈菌16个菌系中呈较低的序列多态性,表明其在条形柄锈菌的进化过程中相对保守.借助荧光假单胞菌EtHAn的三型分泌系统,在小麦细胞中过表达Hasp68能够抑制由非致病细菌引起的PTI (PAMP-triggered immunity)相关胼胝质的积累;同时,也能抑制小麦与无毒条形柄锈菌互作中ETI(effector-triggered immunity)相关的活性氧爆发和过敏性坏死反应,表明效应蛋白Hasp68具有抑制寄主免疫反应的功能.利用酵母双杂交系统筛选Hasp68在小麦中的互作蛋白,发现其与组织蛋白酶B (cathepsin B) TaCTSB互作,双分子荧光技术进一步验证二者在烟草细胞中共表达存在互作,初步揭示了效应蛋白Hasp68的互作靶标.

[背景]肽聚糖(Peptidoglycan,PG)是细菌细胞壁的重要组成部分,而霍乱弧菌 分泌系统(Type Ⅵ Secretion System,T6SS)可以分泌具有肽聚糖水解酶活性的效应蛋白到受体细菌中杀死细胞,这类水解酶的作用机制尚未研究清楚.[目的]通过对细菌细胞壁的PG成分进行研究,建立细胞壁PG成分分析方法,并对霍乱弧菌T6SS分泌的2个破坏细胞壁的效应蛋白TseH和VgrG3的作用机制进行解析.[方法]使用显微镜观察TseH和VgrG3异位表达对宿主细菌生长的影响;纯化大肠杆菌细胞壁,使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察提纯的细胞壁形态;使用纯化的TseH和VgrG3分解消化PG,利用超高效液相色谱-飞行时间质谱(Ultra-Performance Liquid Chromatography-Time-of-Flight Mass Spectrometry,UPLC-TOFMS)分析鉴定消化后的产物成分;通过分析结果推导结构.[结果]通过透射电子显微镜观察,发现提纯的PG呈现半透明的薄膜泡状;通过UPLC-TOFMS的分析以及逆向推导,得到了提纯的PG被VgrG3水解酶降解之后的3种主要产物,分别是二糖二肽(Disaccharide,Di)、二糖三肽(Disaccharide Tripeptide,Tri)和二糖四肽(Disaccharide Tetrapeptide,Tetra).[结论]建立了提纯PG和UPLC-TOFMS分析PG成分的方法,揭示了效应蛋白VgrG3而非TseH可以降解PG多糖链N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β(1-4)糖苷键的功能.由于攻击细胞壁的效应蛋白在革兰氏阴性细菌中广泛存在,本研究不仅为鉴定这类重要效应蛋白的功能提供了有效的方法,而且对研究靶向细胞壁的新型抗生素也有重要的指导作用.