目的 探究长基因间非蛋白编码RNA 92(LINC00092)在骨肉瘤细胞迁移和侵袭进展中的作用及潜在分子机制.方法 采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测人成骨细胞(hFOB1.19)和骨肉瘤细胞系(SOSP-9607、U2-OS、Saos-2 和MG-63)中LINC00092 的表达水平.选取MG-63 细胞并分成LINC00092 组(LINC00092 过表达)、pcDNA组(阴性对照)和Con-trol组(空白对照).采用MTT、Transwell实验和划痕实验体外评估MG-63 细胞的增殖、侵袭和迁移能力.通过双荧光素酶报告基因实验、qPCR 和 Western blot 筛选并证实微小 RNA-373-5p(miR-373-5p)与 LINC00092 的靶向作用关系.结果 与hFOB1.19 细胞相比,LINC00092 在不同骨肉瘤细胞系中的表达均显著异常下调(P＜0.05).与pcDNA组相比,LINC00092 组MG-63 细胞活力、细胞划痕愈合率和细胞穿膜数量均下降.miR-373-5p是LINC00092 的直接靶点且受其负调控(P＜0.05).此外,LINC00092 组增殖细胞核抗原(PCNA)和基质金属蛋白酶 9(MMP9)的 mRNA 和蛋白水平下调(P＜0.05).结论 LINC00092 可以靶向负调控miR-373-5p,并影响PCNA和MMP9 表达,抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程.

目的:探讨咖啡因通过调节FAK/AKT/ROCK信号通路来影响人脑胶质瘤U-373MG细胞的增殖、迁移和侵袭能力.方法:常规培养U-373MG细胞,将其分为对照组、咖啡因低剂量(1 mmol/L)组、咖啡因高剂量(2 mmol/L)组、PF573228组(FAK抑制剂,1 μmol/L)、咖啡因高剂量+SC79组(AKT激活剂,8 mg/L).用CCK-8法、Transwell小室实验、流式细胞术和WB法分别检测各组U-373MG细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡,以及U-373MG细胞中p-FAK、p-AKT、p-ROCK、Ki67、MMP-9蛋白表达水平.建立U-373MG细胞裸鼠移植瘤模型,观察咖啡因对移植瘤生长的影响,WB法检测移植瘤组织中相关蛋白的表达.结果:咖啡因、PF573228可显著抑制U-373MG细胞的增殖、迁移、侵袭能力,促进U-373MG细胞凋亡,抑制p-FAK、p-AKT、p-ROCK、Ki67、MMP-9蛋白的表达(均P<0.05),SC79则可部分逆转咖啡因对U-373MG细胞的作用(均P<0.05).咖啡因可显著抑制移植瘤的生长及移植瘤组织中上述相关蛋白的表达(均P<0.05).结论:咖啡因可通过抑制FAK/AKT/ROCK信号通路抑制U-373MG细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进其凋亡.

[目的]探讨体轴发育抑制因子(axis formation inhibitor,AXIN)在介导神经胶质瘤细胞凋亡中的作用.[方法]取人脑胶质瘤细胞系U373MG培养至对数生长,设为两组,每组设置3个复孔,AXIN过表达组构建AXIN过表达质粒并转染,对照组不给予任何特殊干预.采用Western blotting检测AXIN过表达质粒的表达效果.通过PI染色探究AXIN过表达对神经胶质瘤细胞凋亡水平的影响,通过检测细胞的氧化应激活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平进一步探究细胞凋亡的原因,通过Western blotting进一步探究AXIN对凋亡相关分子的表达调控.[结果]AXIN过表达组AXIN的相对表达量明显高于对照组(P＜0.05);AXIN过表达组细胞凋亡水平明显高于对照组(P＜0.05);AXIN过表达组细胞内ROS含量明显高于对照组(P＜0.05);AXIN过表达组caspase-9、caspase-3蛋白的相对表达量均明显高于对照组(P＜0.05).[结论]AXIN过表达能够促进细胞凋亡,推测与上调caspase-9、caspase-3蛋白,增加ROS含量有关.

目的 探讨高压氧(HBO)联合替莫唑胺(TMZ)对神经胶质瘤U373MG细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 U373MG细胞培养完成后分为4组:对照组(不作HBO及药物处理)、TMZ处理组(只给予50μmol/L TMZ处理)、HBO组(0.24 MPa HBO处理3 h)和HBO+TMZ处理组(HBO预处理3 h后加入50μmol/L TMZ).CCK-8法检测HBO和TMZ单用或联用对U373MG细胞增殖的影响;流式细胞术检测HBO和TMZ单用或联用对U373MG细胞情况及细胞中活性氧(ROS)水平变化情况;Western blotting实验检测U373MG细胞凋亡相关蛋白的表达.结果 HBO+TMZ组中U373MG细胞的增殖抑制情况较TMZ组更明显(P<0.05);TMZ处理组中U373MG细胞出现了早期凋亡和晚期凋亡,HBO+TMZ组中凋亡率明显高于对照组[(73.19±3.58)％vs.(30.5±2.27)％,P<0.01].与空白组和HBO组比较,TMZ组中Bcl-2表达量明显降低,Bax、caspase-3表达量明显升高,且HBO+TMZ组较TMZ组变化更明显(P<0.05或P<0.01).HBO+TMZ组U373MG细胞中ROS水平明显升高(P<0.01);加入ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)后,HBO+TMZ组的细胞凋亡被抑制(P<0.01).结论 HBO联合TMZ能够增强对U373MG细胞增殖的抑制作用,并通过上调节U373MG细胞中的ROS水平促进TMZ诱导细胞凋亡.

目的 探讨miR-32通过靶向调控KLF4影响胶质瘤细胞增殖和侵袭的分子机制.方法 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-32在胶质细胞株(HA)和胶质瘤细胞株(U87、U373MG、U251)中的表达情况;进一步通过细胞增殖(MTT)、细胞侵袭及划痕实验判断miR-32对U87胶质瘤细胞株的影响.之后,利用Target Scan Human 7.1在线检测系统找到miR-32的靶基因,并利用双荧光素酶报告实验进一步验证.验证成功后采用RT-qPCR和蛋白质免疫印迹实验判断miR-32对靶基因KLF4 mRNA的调控,并采用MTT、细胞侵袭及划痕实验进一步判断靶基因KLF4对胶质瘤细胞株的影响.最后利用拯救实验判断miR-32如何调控靶基因KLF4进而影响胶质瘤的增殖和侵袭能力.结果 RT-qPCR结果显示,U87、U373MG及U251细胞株中miR-32的表达水平均显著高于HA细胞株(均P＜0.01).与转染miRNA-NC比较,转染miR-32 mimic的U87细胞株中miR-32的表达水平、增殖、侵袭及迁移能力均显著上调(均P ＜0.05),而转染miR-32 inhibitor的表达水平、增殖、侵袭、迁移能力均显著下调(均P＜0.05).生物信息学和双荧光素酶报告结果显示KLF4为miR-32的靶基因,miR-32过表达,细胞荧光素酶活性显著下降,KLF4表达下调;miR-32表达沉默,细胞荧光素酶活性显著上升,KLF4表达上调.U87、U373MG及U251细胞株中KLF4的表达明显低于HA细胞株(均P＜0.01).KLF4高表达时抑制胶质瘤细胞株的增殖、侵袭及迁移.拯救实验显示,KLF4表达沉默可逆转miR-32表达沉默胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的下调;KLF4过表达时可逆转miR-32过表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭的促进作用.结论 miR-32通过抑制靶基因KLF4的表达促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭.

目的 探讨没食子酸甲酯(methyl gallate,MG)对大鼠胶质瘤细胞C6和人胶质瘤细胞U373增殖和迁移的影响以及抗肿瘤活性和调控机制.方法 MG从簇毛槭茎皮中分离提取,通过MTT法检测MG对胶质瘤细胞活性的影响,BrdU法检测胶质瘤细胞的增殖,应用划痕实验分析MG对胶质瘤细胞迁移的影响.Western blot检测MG对Akt和ERK1/2活性的影响.免疫荧光染色实验观察黏着斑的形成.结果 细胞划痕试验显示,对照组划痕基本愈合,MG(5μg·mL-1)处理组划痕愈合被抑制(P<0.05);外源性Glu可增加细胞的迁移速度和距离,MG预处理抑制Glu诱导的细胞活性和迁移(P均<0.05).Western blot结果显示,在向C6和U373细胞中加入Glu(终浓度150μM)后,Akt的磷酸化水平无变化(P>0.05),ERK1/2磷酸化水平升高(P<0.05).免疫荧光染色结果显示,对照组和Glu处理组中,鬼笔环肽染色无变化,FA的数量和规模增加(P<0.05).NBQX可抑制细胞的存活和迁移(P<0.05).终浓度50μM的钙离子螯合剂BAPTA-AM预处理后,Akt磷酸化水平降低,细胞死亡增加(P<0.05).用5μg·mL-1MG处理细胞,20 min后加入Glu刺激,Western blot结果表明,MG不仅抑制了Akt的磷酸化水平,还抑制了Glu诱导ERK1/2磷酸化;MG抑制Glu诱导的桩蛋白Ser 83磷酸化(P<0.05).结论 MG可抑制大鼠胶质瘤细胞C6和人胶质瘤细胞U373增殖和迁移,可能与抑制Akt和ERK1/2信号通路有关.

目的 探讨肿瘤高表达细胞周期相关蛋白(CREPT)对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能机制.方法 体外培养人胶质瘤细胞株U373、U251、A172、U87-MG、SHG44,并构建过表达或沉默CREPT的U251细胞;免疫印迹法检测蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力.结果 U251细胞CREPT蛋白表达水平最高,SHG44细胞最低.沉默CREPT后,U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显下降(P＜0.05),p-Wnt和p-β-catenin蛋白表达水平下降(P＜0.05).过表达CREPT后,U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显增强(P＜0.05),p-Wnt和p-β-catenin蛋白水平明显升高(P＜0.05).Wnt/β-catenin通路抑制剂KYA 1797K可逆转过表达CREPT对细胞增殖、侵袭和迁移的影响(P＜0.05).结论 CREPT可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和迁移.

目的 构建、筛选并鉴定siRNA-ATF3表达载体,探讨转录激活因子3(ATF3)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制因子(Maspin)和基质金属蛋白酶2(MMP2)在转染了siRNA-ATF3表达载体的人胶质母细胞U373MG细胞株中的表达和意义.方法 构建siRNA-ATF3表达载体,并转染U373MG细胞株,以荧光定量PCR和Western blot检测筛选出有效的siRNA-ATF3表达载体,以免疫细胞化学法检测转染siRNA-ATF3表达载体的U373MG细胞株中ATF3、Maspin和MMP2的蛋白表达情况.结果 U373MG细胞中的ATF3蛋白表达量可被pSilencer siR1-ATF3和pSilencer siR2-ATF3表达载体有效降低.转染siRNA-ATF3表达载体后U373MG细胞生长状态差,增殖速度减慢.ATF3和MMP2在空白组和Control-siRNA组中的阳性表达量高于3个干扰组;与空白组和Control-siRNA组相比,Maspin在ATF3-siRNA组表达最高,在顺铂组和ATF3-siRNA+顺铂组中的表达降低.结论 siRNA-ATF3表达载体有效抑制U373MG细胞的生长和增殖,顺铂可协同增强抑制效果,ATF3、Maspin和MMP2可能协同参与了U373MG细胞的生长和增殖,siRNA-ATF3表达载体可作为治疗抑制胶质母细胞瘤生长增殖的有效手段.

目的 探究MicroRNA-34a-5p(miR-34a-5p)过表达对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其与短蛋白聚糖(BCAN)的靶向关系.方法 收集36例脑胶质瘤患者的脑胶质瘤组织和因脑外伤行内减压术的36例患者的正常脑组织.体外培养人胶质瘤细胞U373、U251 MG、LN229、A172和人正常星形胶质细胞NHA,逆转录定量PCR(RT-qPCR)检测组织/细胞中miR-34a-5p、BCAN mRNA表达水平.取对数生长期的U251 MG细胞,分为对照组(NC组)、mimic-NC组(转染miR-34a-5p mimic阴性对照)、miR-34a-5p过表达组(转染 miR-34a-5p mimic)、miR-34a-5p 过表达+pcDNA3.1-NC 组(miR-34a-5p mimic 和 pcDNA3.1-BCAN 阴性对照空载体质粒共转染)、miR-34a-5p 过表达+pcDNA3.1-BCAN 组(miR-383-5p mimic 和 pcDNA3.1-BCAN 共转染).转染48h后,收集各组细胞用RT-qPCR检测转染效率.MTT法检测细胞增殖活性;划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力;Western Blot检测细胞中BCAN、G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测进一步验证miR-34a-5p与BCAN的靶向关系.结果 胶质瘤组织中BCAN mRNA表达水平显著高于正常组织,而miR-34a-5p的表达水平显著低于正常组织,差异有统计学意义(均P＜0.05);与人正常星形胶质细胞NHA相比,BCAN在人胶质瘤细胞中的表达显著升高(P＜0.05),而miR-34a-5p呈低表达(P＜0.05).转染后,与NC组相比,miR-34a-5p过表达组细胞中miR-34a-5p水平显著升高(P＜0.05),BCAN mRNA和蛋白水平、细胞增殖率、划痕愈合率、穿膜细胞数以及Cyclin D1、PCNA、MMP-2、MMP-9的表达均显著降低(均P＜0.05);在过表达miR-34a-5p的基础上,上调BCAN的表达可显著减弱miR-34a-5p过表达对U251 MG细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(均P＜0.05).双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-34a-5p的高表达可显著抑制BCAN-WT的荧光素酶活性(P＜0.05).结论 miR-34a-5p是BCAN的上游调控因子,过表达miR-34a-5p可靶向下调BCAN的表达,进而抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移侵袭.