目的 探索miR-3133 通过靶向透明质酸合成酶 2(HAS2)促进细胞自噬,抑制血管生成,从而影响布加综合征中隔膜形成的作用,为布加综合征的病因研究提供新的线索,寻求潜在的治疗方法.方法 利用透射电镜观察人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内自噬小体的数量,使用细胞自噬染色检测试剂盒,通过 MDC 法对细胞进行荧光染色,在荧光显微镜下观察自噬性死亡的细胞数量.通过 Western blot 实验检测自噬标志蛋白 p62 和 LC3 的表达改变,从而验证miR-3133 促进自噬的作用.通过CCK-8 实验检测细胞的增殖能力变化,管状形成实验检测细胞形成管道能力的变化,从而验证miR-3133 通过促进自噬抑制血管生成.利用生物信息学软件 miRanda 进行预测,找到有可能成为 miR-3133靶向调控对象的下游基因.转染miR-3133 后使用 Western blot检测 HAS2 的蛋白表达改变,从而验证 miR-3133 能够靶向负调控 HAS2.在使用小干扰 RNA后,检测 HUVECs的增殖能力和血管形成能力变化以及自噬标志蛋白表达的改变,从而验证miR-3133 是通过靶向 HAS2 促进自噬抑制血管形成.结果 透射电镜结果显示转染 miR-3133 mimic的细胞比其阴性对照具有更多的自噬体.在荧光显微镜下 mimic 组中出现更多的 MDC染色;与对照组相比,在 inhibi-tor组中观察到相对较少的 MDC染色.CCK-8 实验表明,miR-3133 mimic减弱了 HUVECs的增殖,而miR-3133 inhibi-tor促进了 HUVECs的增殖.与各对照组相比,miR-3133 mimic 组 p62 蛋白表达显著下调,而 miR-3133 inhibitor 组表达增加,mimic 组 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,而 inhibitor 组降低.Western blot 结果显示,与各自的对照组相比,miR-3133 mimic组中的 HAS2 表达受到抑制,而miR-3133 inhibitor组中的表达上调.然而,miR-3133 未能在mRNA水平上显著调节 HAS2 的表达.HUVECs敲除 HAS2 后,p62 蛋白表达明显降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高.与阴性对照组相比,HAS2 敲除组的 HUVECs细胞增殖率和血管形成率显著降低.结论 miR-3133 可以通过靶向 HAS2 的表达,促进细胞自噬抑制血管生成,进而参与影响布加综合征.

目的 探讨奥美沙坦酯(OMST)抑制衰老相关人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMCs)迁移和侵袭能力的作用及微小RNA(miRNA)参与的机制.方法 HA-VSMCs体外培养,分别经博莱霉素(BLM)诱导衰老、OMST干预及瞬时转染miR-3133 NC/miR-3133 inhibitor.分别设置对照组:HA-VSMCs正常培养;BLM组:HA-VSMCs+BLM;OMST组:HA-VSMCs+BLM+OMST;OMST+miR-3133 NC组:HA-VSMCs转染miR-3133 NC+BLM+OMST;OMST+miR-3133 inhibitor组:HA-VSMCs转染miR-3133 inhibitor+BLM+OMST.划痕实验和Boyden小室侵袭实验分别测定HA-VSMCs迁移和侵袭力.明胶酶谱分析测定HA-VSMCs中金属基质蛋白酶-2(MMP-2)分泌.MiRNA生物芯片测定差异表达miRNA并行qRT-PCR验证.结果 与对照组相比,BLM组划痕实验和侵袭实验显示细胞迁移和侵袭力增加[(78.43±12.76)％vs(42.47±7.22)％;33.33±5.51 vs 13.00±4.36,P<0.05],MMP-2分泌水平增加[1.66±0.27 vs 0.87±0.13,P<0.05];而OMST干预可抑制增加的细胞迁移/侵袭力和MMP-2分泌.生物芯片检测显示,以上3组存在差异miRNAs表达.qRT-PCR证实BLM组miR-3133表达下调,而OMST组miR-3133表达上调.与OMST组相比,OMST+miR-3133 inhibitor组HA-VSMC迁移和侵袭能力增加[(85.87±7.39)％vs(49.77±3.05)％;34.67±2.31 vs 20.00±4.58,P<0.05];MMP-2分泌水平也增加(1.76±0.19 vs 0.94±0.10,P<0.05).结论 OMST能抑制衰老HA-VSMC的迁移和侵袭能力,这一过程可能是通过上调miR-3133表达实现的.

目的 通过构建分子量大小为200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白(FIP200)3'UTR双荧光素酶报告基因载体,研究FIP200与miR-3133的靶向关系.方法 采用生物信息学软件targetscan预测miR-3133与FIP200 3'端非翻译区(3'UTR)潜在的互补结合位点;利用PCR扩增FIP200基因3'UTR序列,并克隆到psicheck2载体中,构建FIP200野生型和突变型重组双荧光素酶报告基因载体;将野生型psicheck2-FIP200-wt 3'UTR或突变型psicheck2-FIP200-mut3'UTR双荧光素酶报告质粒分别与miRNA-3133 mimics或mimics-NC共转染CNE-1细胞;通过双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性,观察miRNA-3133对FIP200表达的影响.结果 生物信息学分析显示FIP200 3'UTR与miRNA-3133有潜在的结合位点,酶切和测序结果表明野生型和突变型双荧光素酶报告载体构建成功;双荧光素酶报告系统检测显示,miRNA-3133可抑制野生型FIP200载体的荧光素酶的表达(P ＜0.05),而对突变型载体的荧光素酶表达无影响(P ＞0.05).结论 成功构建FIP200基因3'UTR的双荧光素酶报告载体,miRNA-3133可以直接靶向调控FIP200基因的表达.