目的 检测膀胱癌中长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA 1,NNT-AS1)表达情况,研究其对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响及可能分子机制.方法 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测膀胱癌组织标本及细胞中LncRNA NNT-AS1表达情况;将膀胱癌细胞转染分为sh-NC组,sh-NNT-AS1组,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组和sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组.采用CCK-8法检测细胞增殖吸光度值(A值);Transwell实验检测细胞迁移、侵袭穿膜数;细胞成球实验检测干细胞干性.检索starBase和TargetScan数据库,并通过双荧光素酶报告基因实验预测验证LncRNA NNT-AS1 和miR-582-5p,miR-582-5p与NCKAP1 的靶向结合关系.Western blot检测膀胱癌干细胞标志蛋白(CD44,ALDH1A1,Oct4,Nanog)及Hippo-YAP/TAZ信号通路相关蛋白表达灰度值.结果 与癌旁组织相比,膀胱癌组织中LncRNA NNT-AS1表达水平(0.34±0.07 vs 1.15±0.21)明显升高,差异有统计学意义(t=16.364,P＜0.001).与人正常膀胱上皮SV-HUC-1 细胞(1.00±0.01)相比,膀胱癌细胞T24,5637,UM-UC-3和TCC-SUP中LncRNA NNT-AS1 表达(6.03±0.17,4.66±0.36,5.47±0.26,3.02±0.20)明显升高,差异有统计学意义(t=17.472～51.160,均P＜0.001).与sh-NC组相比,在24,48和72 h时sh-NNT-AS1组细胞增值能力(A值)均显著降低(0.80±0.01 vs 1.07±0.06,1.18±0..07 vs 1.83±0.03,1.89±0.07 vs 2.53±0.06),差异有统计学意义(t=7.688,14.783,12.024,均P＜0.05);sh-NNT-AS1 组细胞迁移穿膜数(55.00±2.65 个 vs 354.30±7.84 个)、细胞侵袭穿膜数(45.67±2.33 个 vs 303.00±9.07 个)及膀胱癌干细胞成球数(20.85±2.17 个 vs 41.35±3.67 个)显著降低,差异具有统计学意义(t=-62.641,-47.596,8.328,均P＜0.001).与sh-NC组相比,sh-NNT-AS1组细胞中CD44(0.04±0.01 vs 1.12±0.02),ALDH1A1(0.23±0.01 vs 1.16±0.05),Oct4(0.17±0.02 vs 1.10±0.04),Nanog(0.49±0.03 vs 1.24±0.03)的蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=83.656,31.591,36.019,30.619,均P＜0.001).与si-NC组相比,sh-NNT-AS1组CD44+CD133+细胞比例(9.30%±0.79%vs 88.50%±2.77%)明显降低,差异有统计学意义(t=-47.624,P＜0.001).双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-582-5p为LncRNA NNT-AS1靶基因,NCKAP1为miR-582-5p靶基因;LncRNA NNT-AS1 靶向调控miR-582-5p/NCKAP1 轴.与sh-NNT-AS1 组相比,在 24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞增值能力(A值)均明显升高(0.98±0.03 vs 0.73±0.06,1.74±0.04 vs 1.22±0.05,2.33±0.16 vs 1.69±0.14),差异有统计学意义(t=5.977～11.628,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,在 24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组细胞增值能力(A值)显著降低(0.69±0.04,1.01±0.07,1.39±0.08),差异有统计学意义(t=7.877～16.323,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞迁移穿膜数(322.31±28.45个 vs 81.42±13.22 个)、细胞侵袭穿膜数(316.07±30.21 个 vs 92.13±12.65 个)及膀胱癌干细胞成球数(38.55±2.20个 vs 18.98±1.16 个)显著增加,差异具有统计学意义(t=15.115,13.158,14.592,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞CD44(1.05±0.08 vs 0.10±0.01),ALDH1A1(1.20±0.16 vs 0.22±0.02),Oct4(1.32±0.14 vs 0.19±0.03),Nanog(0.97±0.12 vs 0.15±0.04),YAP(1.29±0.11 vs 0.42±0.07)和TAZ(1.41±0.16 vs 0.35±0.05)蛋白表达灰度值均显著增加,差异具有统计学意义(t=10.650～21.243,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组细胞迁移穿膜数(65.33±12.60 个)、细胞侵袭穿膜数(71.08±15.19 个)、膀胱癌干细胞成球数(11.36±1.05 个)均显著降低,差异具有统计学意义(t=16.125,14.395,21.365,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞CD44(0.25±0.05),ALDH1A1(0.61±0.11),Oct4(0.22±0.08),Nanog(0.44±0.07),YAP(0.25±0.09)和TAZ(0.30±0.04)蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=6.412～17.889,均P＜0.001).结论 膀胱癌中LncRNA NNT-AS1 表达上调,其对膀胱癌细胞增殖、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响,可能是通过调控miR-582-5p/NCKAP1 分子轴,激活Hippo-YAP/TAZ信号通路完成.

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)NNT-AS1对膀胱癌细胞增殖、转移及肿瘤干细胞干性的影响和机制.方法 qRT-PCR检测lncRNA NNT-AS1在膀胱癌细胞T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP和膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达,将T24细胞和膀胱癌干细胞分为sh-NC组(转染sh-NC)、sh-NNT-AS1组(转染sh-NNT-AS1)、Control组(共转染sh-NC、inh-NC和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组(共转染sh-NNT-AS1、inh-NC和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组(共转染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组(共转染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和NCKAP1小干扰RNA).CCK8检测各组细胞增殖能力;Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力;细胞成球实验检测各组干细胞干性;流式细胞术检测CD133和CD44表达;双荧光素酶报告基因实验检测lncRNA NNT-AS1与miR-582-5p及miR-582-5p与NCKAP1的靶向关系;体内成瘤实验检测lncRNA NNT-AS1对体内成瘤的影响;Western blot检测NCKAP1、YAP、TAZ、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表达.结果 lncRNA NNT-AS1高表达于T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP细胞.与sh-NC组比较,sh-NNT-AS1组T24细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降(P<0.05),膀胱癌干细胞成球数、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表达及CD133+CD44+细胞比例显著减少(P<0.05).lncRNA NNT-AS1调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴.与Control组比较,sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组细胞光密度(OD)值显著降低(P<0.05),细胞迁移和侵袭数显著减少(P<0.05),膀胱癌干细胞干性显著降低(P<0.05),肿瘤体积显著减小(P<0.05),YAP和TAZ表达显著下调(P<0.05).与sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组比较,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组细胞OD值、细胞迁移数和侵袭数均显著升高/增加(P<0.05),膀胱癌干细胞干性、肿瘤体积显著增加(P<0.05),YAP和TAZ表达均显著升高(P<0.05).与sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组比较,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞OD值、细胞迁移数和侵袭数均显著降低/减少(P<0.05),膀胱癌干细胞干性、肿瘤体积显著减小(P<0.05),YAP和TAZ表达均显著降低(P<0.05).结论 lncRNA NNT-AS1通过调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴影响膀胱癌细胞的增殖、转移及肿瘤干细胞干性,并激活Hippo-YAP/TAZ信号通路.