目的:研究miRNA-326是否作用于其靶基因 BCL- XL，探讨miRNA调控血小板凋亡的分子机制。 方法:利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统，分别构建含有 BCL- XL 3′端非翻译区(3′ untranslated region，3′UTR)片段的野生型和变异型的双荧光素酶载体，设置对照组，转染细胞检测相对荧光强度。 结果:分别构建了PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-WT(野生型)和PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-MT(变异型)的双荧光素酶报告基因质粒载体；miRNA-326序列和PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-WT质粒共转染测定的相对荧光强度显著低于对照组(miRNA-326阴性对照序列和PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-WT质粒共转染组)( P＝0.034)；同时也显著低于miRNA-326序列和PsiCHECK- BCL- XL-3′UTR-MT质粒共转染的变异组( P＝0.022)。 结论:miRNA-326作用于 BCL- XL基因的3′UTR；这为研究miRNA调控血小板凋亡的分子机制奠定了基础。

目的 分析头颈部鳞癌(含皮肤鳞癌)中基质金属蛋白酶1(MMP1)和微RNA(miRNA)表达水平并筛选目标miRNA.方法 下载GEO相关数据,比较头颈部鳞癌MMP1表达水平.利用miRanda、TargetScan7.2和miRDB软件在线预测miRNA,进一步与miRTarBase结果做比对,获得目标miRNA并进行验证.分析目标miRNA与MMP1的相互关系.结果 与正常组织或不典型增生病变相比,MMP1在头颈部鳞癌(含皮肤鳞癌)组织中高表达,MMP1可参与癌变整个发展过程,并促进HNSCC转移;在线预测共获得3个目标miRNAs:miR-202、miR-326和miR-488,其中miR-202 mirSVR评分最高.相反,与正常组织相比,miR-202头颈部鳞癌(含皮肤鳞癌)中,miR-202表达水平明显低于正常组织,从正常皮肤-KIN1/2-KIN3-cSCC,miR-202可参与疾病整个发展过程.相关分析显示miR-202表达与MMP1呈负相关(r=-0.14,P＜0.05).结论 MMP1在头颈部鳞癌(含皮肤鳞癌)组织中高表达,miR-202低表达,miR-202可能是调节MMP1的真实miRNA,二者呈负相关.

目的 研究长链非编码RNA(lncRNA)Dancr在肝脏中的时空表达规律,探索其与糖异生的可能调控关系与分子机制.方法 建立小鼠饥饿-再喂养模型、高脂饮食诱导的肥胖(high-fat diet,HFD)模型,并以磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶为阳性对照,检测Dancr在两组模型小鼠肝脏中的表达;分离小鼠主要脏器组织,检测不同组织中Dancr的表达量;运用NCBI、UCSC、RegRNA、TargetScan等数据库,分析Dancr的序列特征,预测与其相互作用的miRNA,并对miRNA下游靶基因进行基因本体和京都基因与基因组百科全书分析.采用Student-t检验分析各组之间差异的显著性,采用单因素方差分析比较多组间差异.结果 Dancr的表达量随饥饿进程持续升高,并在16 h达到最高,再进食后迅速恢复正常水平(4.20±0.27比1.00±0.23,t=22.10,P<0.01).在HFD小鼠肝脏中Dancr表达量同样显著升高(1.69±0.30比1.00±0.25,t=4.33,P<0.01).Dancr在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌、小肠、胃、白色脂肪组织、棕色脂肪组织和脑组织中表达差异有统计学意义(F=180.32,均P<0.01),Dancr在肝脏中的表达量显著高于除脾、肺外的其余组织(t=6.03～36.19,均P<0.01).在线分析Dancr位于chr5:74,093,083-74,090,355,全长1060 bp,由2个外显子构成,可能存在9个与之相互作用的miRNAs(mmu-let-7i-5p、mmu-miR-134-5p、mmu-miR-326-5p、mmu-miR-433-5p、mmu-miR-497-5p、mmu-miR-504-3p、mmu-miR-1906、mmu-miR-432、mmu-miR-5620-5p),调节下游2124个靶基因,其中多条基因与糖异生调控相关.结论 Dancr的表达受生理及病理性糖异生信号影响,可能介导肝脏糖异生的调控,且生物信息学分析为后续实验提供了一定的数据支持,有助于我们进一步了解Dancr在糖异生调控中的分子机制.

目的:探讨微小RNA-326(miRNA-326)调控胃癌细胞活力和凋亡的机制及其在胃癌组织中的表达及临床意义.方法:采用RT-qPCR检测miRNA-326在55例胃癌组织中的表达情况,并分析其与临床病理特征的关系.以胃癌细胞BGC-823为研究对象,RT-qPCR检测miRNA-326在细胞中的表达;将BGC-823细胞随机分为正常对照组(未转染)、mimic-NC组(转染mimic阴性对照)和miRNA-326 mimic组(转染miRNA-326 mimic),以脂质体转染法上调miRNA-326表达后,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)、p21、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Bcl-2和cleaved caspase-3的蛋白水平,RT-qPCR检测cyclin D1的mRNA表达,双萤光素酶报告基因检测法验证CCND1(cyclin D1的基因)是否是miRNA-326的靶基因.结果:miRNA-326在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P<0.05),其表达与肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度及临床分期均有显著相关性(P<0.05),而与患者的年龄和性别无关;此外,还与患者生存率密切相关(P<0.05).miRNA-326在BGC-823细胞中的表达明显低于正常胃黏膜GES-1细胞(P<0.05).与正常对照组相比,mimic-NC组细胞中miRNA-326的表达无明显变化,而miRNA-326 mimic组细胞中miRNA-326的表达明显升高(P<0.05).与正常对照组相比,miRNA-326 mimic组细胞活力明显减弱,而细胞凋亡增强(P<0.05);此外,与正常对照组相比,miRNA-326 mimic组细胞中MMP-9、cyclin D1、Bcl-2蛋白及cyclin D1 mRNA表达下降,而p21和cleaved caspase-3的蛋白水平上升(P<0.05).然而,mimic-NC组与正常对照组相比,各检测指标的差异均无统计学显著性.与mimic-NC+miR-326 mimics组相比,转染pmiR-CCND1-WT质粒细胞的萤光素酶活性降低(P<0.05),而转染pmiR-CCND1-Mut质粒的萤光素酶活性无改变.结论:miRNA-326在胃癌组织中低表达,可能通过靶向调控CCND1表达而促进细胞活力并抑制细胞凋亡.

目的 评估环状蛋白质精氨酸甲基转移酶5(circPRMT5)在结直肠癌发生、发展中的作用.方法 收集2013年1月至2017年12月上海健康医学院附属嘉定区中心医院普外科行结直肠癌根治术患者96例.采用实时荧光定量PCR检测circPRMT5在结直肠癌组织中的表达水平;分析circPRMT5表达水平与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤最大径、肿瘤位置、病理分化、TNM分期、淋巴结转移等因素的相关性.将结直肠癌细胞株SW620和LOVO按不同的处理方式分为对照组、circPRMT5-1enti组和circPRMT5-shRNA-lenti组,检测circPRMT5表达水平对SW620和LOVO细胞活性、凋亡、线粒体膜电位、迁移的影响.采用蛋白质印迹法检测circPRMT5表达水平对上皮钙黏蛋白、Slug、神经钙黏蛋白和波形蛋白表达的影响.采用Starbase V2.0软件预测circPRMT5的潜在靶miRNA.统计学分析采用Student￡检验、方差分析和卡方检验.结果 实时荧光定量PCR结果显示,结直肠癌组织中circPRMT5表达水平高于癌旁组织(2.167±0.345比1.103±0.144),差异有统计学意义(t=26.847,P＜0.01),其表达水平与肿瘤最大径、TNM分期、淋巴结转移和远处转移显著相关(x2=6.010、10.971、5.321、6.272,P均＜0.05).circPRMT5表达上调可以促进SW620和LOVO细胞的增殖和迁移;circPRMT5表达下调可以抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,且降低细胞线粒体膜电位.蛋白质印迹结果显示,与对照组相比,circPRMT5-lenti组Slug、神经钙黏蛋白和波形蛋白表达均升高(分别为1.023±0.038比2.105±0.042,1.051±0.309比2.277 ±0.111,1.055±0.040比2.002±0.537),上皮钙黏蛋白表达降低(2.074±0.214比0.627±0.023),差异均有统计学意义(t=31.817、22.065、14.536、9.148,P均＜0.01);circPRMT5-shRNA-lenti组Slug、神经钙黏蛋白和波形蛋白表达均降低(1.023±0.038比0.585±0.023,1.051±0.309比0.616±0.043,1.055±0.040比0.537±0.022),上皮钙黏蛋白表达升高(2.074±0.214比2.756±0.148),差异均有统计学意义(t=-13.795、-14.252、-11.794、-13.116,P均＜0.05).Starbase V2.0软件预测共有21个miRNA与circPRMT5存在潜在结合位点,并且实时荧光定量PCR检测证实SW620和LOVO细胞中miRNA4735-3p、miRNA202-3p、miRNA326、let-7i-5p、miRNA4500与circPRMT5表达水平呈负相关.结论 circPRMT5是结直肠癌发生、发展中的重要促癌基因,在结直肠癌靶向药物研发中具有一定应用前景.

目的 探讨微小RNA-326( miR-326)对Twist同系物1( TWIST1)表达及肝癌细胞上皮间质转化( EMT)的影响.方法 采用实时定量PCR(QPCR)检测人正常肝细胞(LO2)和肝癌细胞(HepG2、SMMC-7721、BEL7402和MHCC-97H)中miR-326的表达量.脂质体法向SMMC-7721细胞分别转染miR-326模拟物(过表达组)和阴性对照序列( NC组),QPCR检测miR-326水平,活细胞计数CCK-8试剂盒检测增殖能力,划痕愈合实验和Transwell小室实验分别检测划痕愈合率和穿膜细胞数,双荧光素酶报告基因实验验证miR-326与TWIST1的靶向关系,QPCR和Western blotting检测EMT 相关因子的mRNA和蛋白水平.结果 与LO2细胞相比(1. 021±0. 072),肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、BEL7402和MHCC-97H中miR-326的相对表达量显著下调(P＜0. 01).对照组、NC组和过表达组的miR-326水平依次为1. 012±0. 071、1. 032±0. 045和10. 752±0. 847,与其余两组相比,过表达组的 miR-326水平升高( P＜0. 05);过表达组转染24～48 h的增殖活性低于对照组和 NC 组( P＜0. 05);过表达组的划痕愈合率和穿膜细胞数分别为(23. 119±2. 523)%和(107. 5±11. 6)个,低于对照组的(62. 158±3. 578)%和(215. 4±18. 4)个及NC组的(59. 473±4. 106)%和(229. 3±21. 5)个(P＜0. 05).与对照组和NC组相比,过表达组的波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和TWIST1水平下降,而E-钙黏蛋白水平升高( P＜0. 05). miR-326抑制TWIST1野生型3′端非翻译区的荧光素酶活性(P＜0. 05),而对突变型的无影响(P＞0. 05).结论 肝癌细胞中miR-326表达下调,且过表达miR-326可抑制EMT,可能通过靶向TWIST1来发挥肿瘤抑制作用,该miRNA可作为潜在的肝癌诊疗靶点.

目的 探讨维生素K2联合磷脂酰胆碱抑制人肝癌细胞的分子机制.方法 维生素K2联合磷脂酰胆碱处理人肝癌细胞(SMMC-7721)48 h,使用微小RNA(miRNA,miR)芯片检测处理后的人肝癌细胞miRNA表达水平,采用生物信息学预测miRNA的靶基因及靶基因所参与的功能分类、细胞信号通路,最后通过免疫蛋白印迹实验验证细胞信号通路的关键蛋白表达.结果 共有65个miRNA表达水平被显著上调或下调2倍以上,miR-16的表达水平变异最大,对比对照组上调了8 171.07倍(t=6.238,P＜0.01).65个miRNA分别有8～326个靶向基因,主要分布于上调部分和生物过程,其中miR-16有164个靶向基因.将靶向基因映射到信号通路后,Wnt信号通路富集靶基因最显著,有58个靶向基因(t=8.753,P＜0.01).免疫蛋白印迹实验中WNT3A和磷酸化β-连环蛋白(β-catenin)的低表达证实了经典Wnt信号通路参与了维生素K2联合磷脂酰胆碱抑制人肝癌细胞的过程(t=5.354,P＜0.01).结论 维生素K2联合磷脂酰胆碱通过上调miR-16表达,抑制Wnt信号通路,达到抑制人肝癌细胞的效果.

目的 探讨微小RNA-1180( miR-1180)对肝癌细胞侵袭迁移和转化生长因子β( TGF-β)信号通路的影响.方法 采用实时定量PCR(QPCR)检测正常肝上皮细胞LO2和肝癌细胞( MHCC97-H、Huh7、SMMC-7721)的miR-1180水平;常规培养SMMC-7721细胞并采用脂质体介导转染miR-1180抑制物(Inhibitor组)或阴性对照(NC组)并以不行任何处理的细胞为对照组;分别采用MTT比色法、划痕实验和Transwell实验检测miR-1180水平、划痕愈合率和穿膜细胞数,通过生物信息学和双荧光素酶报告基因系统验证miR-1180与分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)的靶向调控关系;QPCR和Western blotting检测SFRP1、TGF-β1、基质金属蛋白酶( MMP)-3和MMP-9水平.结果 与LO2细胞相比,肝癌细胞的miR-1180水平均升高(P＜0. 05).与对照组和NC组相比,Inhibitor组的miR-1180水平及转染48、72 h的增殖活力均降低(P＜0. 05). Inhibitor组的划痕愈合率和穿膜细胞数分别为(19. 264± 4. 619)%和(133. 863± 16. 216)个,低于NC组的(67. 579± 7. 734)%和( 316. 906± 25. 753)个及对照组的( 65. 237 ± 5. 621)%和( 326. 815± 28. 946)个,差异有统计学意义( P＜0. 05). Inhibitor 组的 TGF-β1、MMP-3和MMP-9水平均低于对照组和NC组(P＜0. 05),而SFRP1水平高于对照组和NC组(P＜0. 05),而SFRP1水平高于对照组和NC组.对照组和NC组上述指标的差异无统计学意义(P＞0. 05). MiR-1180模拟物可降低携带野生型SFRP1 3’端非翻译区载体转染细胞的相对荧光强度(P＜0. 05).结论 肝癌细胞中miR-1180高表达,该miRNA可能通过靶向SFRP1来激活TGF-β信号通路,在促进肝癌迁移和侵袭过程中发挥作用,可作为肝癌的一个新且有前景的治疗靶点.

目的 观察环状RNA含有16A的脱水酶结构域分子(circRNA ABHD16A)-微小RNA(miRNA,miR)-1237-5p-细胞凋亡相关酪氨酸激酶(AATK)轴对乳腺癌细胞密歇根癌症基金会7号细胞(MCF-7)凋亡的影响.方法 运用中国科学引文数据库(CSCD)和Target Scan在线分析分别分析ABHD16A与miR-1237-5p和miR-1237-5p与AATK的相关性.利用Luciferase assay检测circRNA ABHD16A是否靶向miR-1237-5p以及miR-1237-5p是否靶向AATK.在过表达或敲低circRNA ABHD16A的情况下,通过蛋白质印迹法(Western blot)检测AATK和乳腺癌细胞MCF-7凋亡标志蛋白表达;通过噻唑蓝(MTT)实验分析乳腺癌细胞MCF-7的细胞活力;通过磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V)染色检测乳腺癌细胞MCF-7的凋亡水平.Student's t检验分析两组单向方差分析.结果 circRNA ABHD16A靶向miR-1237-5p;miR-1237-5p靶向AATK3'UTR的320-326和469-475区域.过表达ABHD16A时,AATK的表达量明显上升(t=15.295,P＜0.01),细胞凋亡相关蛋白bcl-2拮抗剂(bak),bcl-2相关X凋亡调节因子(bax)和被切割的胱天蛋白酶9(cleaved-Cas9)的表达量明显上升(t =7.403、8.381、21.583,P＜0.01),而bcl-2细胞凋亡调节剂(bcl-2)的表达量明显下降(t =6.301,P＜0.01),MCF7细胞活力水平下降(t=17.392,P＜0.01),凋亡水平上升(t=8.491,P＜0.05).敲低ABHD16A时,AATK的表达量明显下降(t=9.290,P＜0.01),细胞凋亡相关蛋白bak、bax和cleaved-Cas9的表达量明显下降(t=8.381、5.296、11.492,P＜0.01),而bcl-2的表达量明显上升(t =5.609,P＜0.01),MCF7细胞活力水平上升(t=5.694,P＜0.01),凋亡水平下降(t=13.502,P＜0.01).结论 circRNA ABHD16A靶向miR-1237-5p后增加AATK的表达量,并促进乳腺癌细胞MCF-7凋亡.

目的:探讨过表达miRNA-326对椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)髓核(nucleus pulposus,NP)细胞凋亡的影响及其作用机制.方法:构建miRNA-326慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,经感染NP细胞得到稳定过表达细胞系GV369-miRNA-326-NP,同时设置空载体GV369-NP组与空白组.荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白[绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)]的表达,实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测miRNA-326的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光素酶报告基因分析验证miRNA-326与FasL的靶向关系,蛋白质印迹法检测细胞中凋亡相关蛋白FADD,caspase-3,Bcl-2及Bax的表达,使用试剂盒检测细胞线粒体膜电势的变化情况.结果:荧光显微镜下示,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白组未见绿色荧光.与空白组相比,GV369-miRNA-326-NP组中miRNA-326的表达水平、Bcl-2表达水平和线粒体膜电位明显升高,而细胞凋亡率,FADD,caspase-3和Bax的表达水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);GV369-NP组与空白组相比,差异无统计学意义(P>0.05).荧光素酶报告基因分析证实miRNA-326与FasL存在靶向关系.结论:MiRNA-326可抑制IDD NP细胞发生凋亡,既可通过靶向性调控外源性FasL/Fas通路参与caspase-3和FADD介导的细胞凋亡,也可通过线粒体途径对细胞凋亡发挥作用.