目的:构建铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-LasR，并在大肠埃希菌中研究其表达效率。方法:提取铜绿假单胞菌PA01株DNA，PCR扩增 lasR基因，并将其与pGEX-1λT连接，构建重组质粒pGEX-LasR。将pGEX-LasR转入大肠埃希菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定，然后异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-PAGE和Western印迹试验分析和鉴定表达产物。 结果:PCR扩增出717 bp的 lasR基因；双酶切和PCR显示重组质粒构建成功；SDS-PAGE发现重组BL21(DE3)可表达相对分子质量约为53 000的LasR重组蛋白，表达量约占菌体总量的21%。Western印迹试验显示，LasR重组蛋白可与铜绿假单胞菌感染的鼠血清发生特异性反应。 结论:本研究成功构建了 lasR基因的原核表达载体pGEX-LasR，该质粒可在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效率表达具有免疫反应性的LasR重组蛋白。

目的 构建以粪肠球菌为载体的铜绿假单胞菌重组Ef-LasR疫苗,并研究其表达效率.方法 采用PCR扩增铜绿假单胞菌标准株PA01的LasR基因,然后克隆至pGEX-1λT载体,构建重组质粒pGEX-LasR.将重组质粒电穿孔转化感受态粪肠球菌构建重组Ef-LasR疫苗,抽提质粒进行PCR和双酶切鉴定.重组疫苗用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 PCR扩增出717 bp的LasR基因;双酶切和PCR证实重组疫苗(rEf-LasR)构建正确;SDS-PAGE显示rEf LasR能够高效表达分子质量单位为53 ku的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被铜绿假单胞菌感染的鼠血清识别.结论 成功构建了重组Ef-LasR疫苗,其表达产物具有反应原性,为铜绿假单胞菌疫苗的进一步研究奠定了基础.

目的 研究以粪肠球菌(Ef)为载体的铜绿假单胞菌(Pa)LasR蛋白重组疫苗rEf(pGEX-LasR)免疫小鼠的保护作用.方法 分别将重组疫苗、空载体菌株和Ef以5×109 CFU的剂量口服灌胃免疫BALB/c小鼠,每周3次,连续3周,第4周采用5×107 CFU剂量的Pa(Pa01株)菌液滴鼻攻击小鼠.攻击后2周检测小鼠肺细菌负荷,并于免疫前、初次免疫后4周和攻击后2周采集小鼠血液,ELISA检测血清特异性IgA、IgE、IgG及其亚类(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)水平.结果 疫苗组、空载体组和Ef对照组小鼠肺细菌负荷分别为(7.62±0.01)lgCFU/g、(8.88±0.01)lgCFU/g和(8.90±0.01)lgCFU/g,疫苗组明显低于空载体组和Ef对照组(P<0.001).与免疫前比较,疫苗组小鼠血清IgG及其亚类和IgE在免疫后4周显著升高,在攻击后2周进一步升高(均P<0.01),且在初免后4周及攻击后2周均显著高于空载体组和Ef对照组(均P<0.01).三组小鼠免疫前后均未检测出血清特异性IgA.结论 Pa重组疫苗rEf(pGEX-LasR)可诱导小鼠产生体液免疫应答,降低Pa攻击小鼠后的肺细菌负荷.

目的 研究基于粪肠球菌(Ef)载体的铜绿假单胞菌(Pa)重组疫苗rEf(pGEX-LasR)诱导小鼠的保护力及细胞免疫应答.方法 分别将5×109CFU的疫苗株、空载体株和Ef株菌液口服灌胃免疫BALB/c鼠,每周3次,连续3周;初次免疫后4周用5×107CFU的Pa01株菌液滴鼻攻击小鼠,2周后杀鼠剖检;菌落计数检测小鼠肺细菌负荷,MTT法检测小鼠脾细胞增殖水平,荧光激活细胞分选仪(FACS)检测小鼠脾细胞CD4+/CD8+T细胞亚群和脾细胞凋亡水平;采用PaAg体外刺激培养小鼠脾细胞48 h,PCR扩增IL-2、IFN-y、IL-12、IL-17和Fox3+基因.结果 疫苗组、空载体组和 Ef 对照组小鼠肺细菌负荷分别为(7.616士0.010)lgCFU/g、(8.876±0.011)lgCFU/g 和(8.902±0.010)lgC-FU/g,疫苗组显著降低(P＜0.01);与空载体组和Ef对照组比较,疫苗组小鼠脾细胞CD4+T细胞亚群显著增加(P＜0.01),脾细胞增殖活性增强(P＜0.01)、凋亡率减低(P＜0.01);疫苗组小鼠脾细胞DNA可扩增出IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-17和Fox3+基因条带,空载体组和对照组未扩增出条带.结论 Pa重组疫苗rEf(pGEX-LasR)可诱导小鼠产生细胞免疫应答,促进小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-17和Fox3+基因的表达,降低Pa01攻击小鼠后的肺细菌负荷.