-
侧链二氧酸脱氢酶复合体E2蛋白关键性氨基酸在原发性胆汁性胆管炎诊断中的意义
编辑人员丨5天前
目的:探究与自身抗体抗线粒体抗体Ⅱ型(AMA-M2)发生反应的侧链二氧酸脱氢酶复合体E2蛋白(BCOADC-E2)关键性氨基酸在原发性胆汁性胆管炎(PBC)诊断中的价值。方法:克隆能够表达BCOADC-E2蛋白抗原表位同源目的基因序列BCKD,与工程质粒pGEX-4T1进行DNA重组,通过PCR获得15个点突变质粒,转入原核表达菌株中进行蛋白表达与纯化;ELISA法、蛋白质印迹法鉴定其与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度并进行分析比较,定位出对BCOADC-E2蛋白和AMA-M2特异性反应有关键影响的氨基酸,探讨其在PBC诊断中的价值。统计学处理采用单因素方差分析、两两比较采用LSD- t检验。 结果:共获得14个突变型蛋白、1个野生型蛋白。突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A和pGEX-BCKD-C3A与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD与AMA-M2特异性反应程度;突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A(1.634±0.328)和pGEX-BCKD-C3A(1.744±0.345)与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD(1.000±0.000)与AMA-M2特异性反应程度;突变型蛋白pGEX-BCKD-E4A(0.157±0.067)、pGEX-BCKD-V5A(0.057±0.029)、pGEX-BCKD-Q6A(0.580±0.166)、pGEX-BCKD-S7A(0.744±0.125)、pGEX-BCKD-D8A(0.351±0.135)、pGEX-BCKD-S10A(0.496±0.158)、pGEX-BCKD-V11A(0.149±0.089)、pGEX-BCKD-T12A(0.061±0.043)、pGEX-BCKD-I13A(0.007±0.017)、pGEX-BCKD-T14A(0.198±0.101)、pGEX-BCKD-S15A(0.156±0.087)、pGEX-BCKD-R16A(0.884±0.099)与AMA-M2特异性反应程度均低于野生型蛋白pGEX-BCKD(1.000±0.000)与AMA-M2特异性反应蛋白。结论:BCOADC-E2蛋白的1号和3号位半胱氨酸是提高蛋白BCOADC-E2与PBC患者血清AMA-M2特异性反应关键性氨基酸;4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16号位氨基酸被丙氨酸代替后形成突变型蛋白会降低其与AMA-M2特异性反应程度;5号位和13号位氨基酸是影响蛋白BCOADC-E2与AMA-M2特异性反应关键性氨基酸,对BCOADC-E2蛋白功能有着重要影响,对BCOADC-E2关键性氨基酸进行深入研究对PBC诊治有重要意义。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
早老蛋白增强子2基因沉默对HaCaT细胞增殖及γ分泌酶表达的影响
编辑人员丨5天前
目的:构建早老蛋白增强子2(PSENEN)基因沉默的人永生化角质形成细胞(HaCaT)模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染:shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液,NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液,空白组不加病毒液。转染完成后,荧光显微镜下观察荧光表达,流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性,实时荧光定量PCR(qPCR)、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白(NCT)、早老蛋白1(PS1)、前咽缺陷蛋白1a(APH1a)mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达,流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示,与NC组(1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075)相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA(0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009)、蛋白(0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062)表达均显著降低(均 P < 0.001)。CCK8法显示,与NC组相比,shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高(均 P < 0.05),24和60 h差异无统计学意义(均 P > 0.05);shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组(均 P < 0.05)。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义( F值分别为8.168、4.644、1.981,均 P > 0.05),mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义( F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663,均 P ≤ 0.01)。与NC组相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低(均 P < 0.01),imNCT蛋白表达变化无统计学意义(均 P > 0.05)。 结论:成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型,PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强,γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
靶向甲型流感病毒血凝素蛋白的广谱抗体制备及鉴定
编辑人员丨5天前
目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白的广谱抗体FHA3,并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)序列信息,PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列,连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ,构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合,且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性,在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞,在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
甲型流感病毒血凝素头部蛋白结构域的原核表达及血清学分析
编辑人员丨5天前
目的:在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法:将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中,通过IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白,验证表达的准确性,Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白,多剂次免疫家兔,获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时,重组蛋白免疫BALB/c小鼠,评价其免疫原性。结果:rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体,可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体,可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论:本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原,在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体,可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
细粒棘球蚴EgG1Y162-2基因的克隆、蛋白表达及纯化鉴定
编辑人员丨5天前
目的:构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒,诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白,为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法:以细粒棘球蚴cDNA为模板,利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因,经限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒;将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达大量蛋白,采用亲和层析方法纯化重组蛋白;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白纯化水平,蛋白免疫印迹(Western blot)法鉴定表达产物。 结果:成功构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒,诱导表达后菌体上清液和洗脱液均在相对分子质量约15 × 10 3处出现EgG1Y162-2蛋白目的条带,且200 mmol/L咪唑洗脱的蛋白抗原成分较纯。Western blot结果显示,纯化后带有His标签的EgG1Y162-2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。 结论:成功构建了细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒,诱导表达了EgG1Y162-2重组蛋白,为进一步开展抗细粒棘球蚴疫苗的研究奠定基础。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
LncRNA MEG3过表达对胰腺癌细胞PANC1自噬、凋亡及mTOR通路的影响
编辑人员丨5天前
目的:本研究旨在探讨长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)过表达对胰腺癌细胞(PANC1)自噬、凋亡及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的影响。方法:构建pCMV-N-Flag-MEG3表达质粒并转染入PANC1细胞。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测HPDE6C7(正常胰腺细胞)组、PANC1(空白对照)组、Vector(PANC1细胞转染空载体)组和MEG3(PANC1细胞转染pCMV-N-Flag-MEG3重组质粒)组中LncRNA MEG3表达量;四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法、流式细胞术和单丹磺酰尸胺(MDC)染色法分别检测LncRNA MEG3过表达对胰腺癌细胞PANC1增殖、凋亡和自噬的影响;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测LncRNA MEG3过表达对胰腺癌细胞PANC1中抑凋亡因子(Bcl-2)、促凋亡因子(Bax)和自噬因子(Beclin 1)蛋白表达水平及mTOR通路中mTOR、核糖体p70S6激酶蛋白(SK61)和核起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)磷酸化水平的影响。结果:与PANC1组和Vector组相比,MEG3组LncRNA MEG3表达水平(0.36±0.08 vs 0.35±0.11 vs 0.69±0.09)、胰腺癌细胞PANC1增殖抑制率(3.35%±0.12% vs 3.23%±0.09% vs 36.77%±0.13%)、自噬率(29.32%±1.03% vs 26.73%±1.32% vs 57.76%±1.09%)、凋亡率(9.85%±1.58% vs 9.73%±1.12% vs 35.89%±1.05%)、Bax(0.26±0.08 vs 0.29±0.05 vs 0.83±0.08)和Beclin 1(0.15±0.06 vs 0.17±0.02 vs 0.61±0.03)表达水平显著升高(均 P < 0.05),Bcl-2表达水平(0.79±0.12 vs 0.81±0.09 vs 0.30±0.03)及mTOR通路中mTOR(1.08±0.05 vs 1.06±0.08 vs 0.37±0.10)、SK61(1.12±0.06 vs 1.11±0.09 vs 0.41±0.03)和4E-BP1(0.97±0.07 vs 0.95±0.03 vs 0.39±0.05)磷酸化水平显著降低(均 P<0.05)。 结论:LncRNA MEG3过表达能抑制胰腺癌细胞PANC1增殖促进细胞凋亡,促进细胞自噬囊泡的形成,可能与阻滞mTOR通路有关。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
携带Decorin基因的质粒DNA构建及其对兔耳增生性瘢痕的治疗作用
编辑人员丨5天前
目的:探讨携带核心蛋白聚糖( decorin,DCN)基因的重组质粒对兔耳增生性瘢痕的治疗作用。 方法:将PCR扩增的人 Decorin基因片段克隆到质粒载体pUDK上构建重组质粒pDCN,并进行酶切和测序鉴定。重组质粒 pDCN转染293T细胞,并检测细胞内 DCN及TGF-β1的表达。建立兔耳增生性瘢痕模型,将12只新西兰大白兔采用随机数字表法分为PBS组、空质粒组、rhDCN组、pDCN低剂量(20 μg/cm 2)组、pDCN中剂量(40 μg/cm 2)组、pDCN高剂量(60 μg/cm 2)组,观察肥大指数、瘢痕组织病理改变及 DCN表达等,研究pDCN对兔耳增生性瘢痕的治疗作用。 结果:经过酶切、测序鉴定, Decorin基因片段成功插入质粒载体pUDK上,重组质粒 pDCN构建成功。 pDCN转染至293T细胞后, DCN的RNA及蛋白表达水平均上调,TGF-β1表达受到抑制。应用不同剂量的 pDCN实验性治疗兔耳增生性瘢痕,结果显示pDCN中剂量组兔耳瘢痕的肥大指数(1.61±0.40)显著小于PBS组(2.07±0.55)( P<0.05),而pDCN低剂量和高剂量组肥大指数均与PBS组没有显著差异。免疫组织化学结果显示,pDCN中剂量组中兔耳局部 DCN表达显著高于PBS组( P<0.05);同时,病理检测显示瘢痕组织中炎性细胞浸润明显减少,纤维沉积减少,表明中剂量 pDCN可有效抑制兔耳增生性瘢痕的增生。 结论:携带 Decorin基因的质粒 pDCN通过抑制TGF-β1表达,对兔耳增生性瘢痕有一定的治疗作用。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
周期型马来丝虫复合表位基因的构建及在真核细胞中的表达
编辑人员丨5天前
目的:构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶复合表位基因(CPI502/GAPDH720)真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并观察其在人宫颈癌细胞(Hela细胞)中的蛋白表达。方法:根据T细胞表位预测的基因序列设计引物,以质粒pGEM-T-CPI621为模版,利用反转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,将该片段克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28a(+)-BmCPI502。根据软件设计合适引物,RT-PCR分别扩增BmCPI502基因和BmGAPDH720基因,pcDNA3.1(+)、BmCPI502、BmGAPDH720分别进行双酶切后进行连接,构建复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720。将复合表位基因重组质粒转染至Hela细胞后,进行RT-PCR验证,获得与预期相符目的条带;将表达产物利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。结果:获得了原核表达重组质粒pET28a(+)-BmCPI502,经酶切鉴定得到502 bp特异性片段,与预期值符合;成功构建了复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,酶切鉴定所产生的片段大小与预期符合;复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720转染Hela细胞后得到稳定表达,SDS-PAGE鉴定分析显示重组蛋白相对分子质量( Mr × 10 3)约为50。 结论:成功构建了周期型马来丝虫复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并在真核细胞中获得相应的重组蛋白,为进一步研究重组蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
神经纤毛蛋白质1、存活素双基因联合沉默抑制鼻咽癌细胞生长增殖的研究
编辑人员丨5天前
目的:构建同时表达神经纤毛蛋白质1(NRP-1)和存活素(Survivin)双基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,通过体内外实验,观察其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响。方法:构建同时表达NRP-1和Survivin双基因的质粒(Plasmid-1),并构建单独表达NRP-1和Survivin基因质粒(分别为Plasmid-2、Plasmid-3)。转染入鼻咽癌CNE-2Z细胞株,于荧光显微镜观察质粒转染及表达情况;以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力;定量聚合酶链反应(PCR)及免疫印迹法(Western blot)在mRNA水平和蛋白水平上检测目的基因抑制作用。建立稳定转染裸鼠移植瘤模型,体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果。原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测移植瘤细胞凋亡率。多组间比较采用单因素方差分析。结果:通过测序证实重组shRNA真核表达载体构建成功。各重组质粒表达载体成功转染CNE-2Z细胞,可见大量的癌细胞表达绿色荧光。MTT显示细胞增殖受到抑制,且双基因干扰质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因干扰质粒,差异有统计学意义(0.209±0.021比0.392±0.013、0.384±0.014, F=354.121, P<0.05)。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实双基因联合沉默组和单基因沉默组均能有效抑制目的基因mRNA表达,双基因组NRP-1 mRNA(0.20±0.06)表达明显低于NRP-1单基因组(0.27±0.05),差异有统计学意义( F=198.437, P<0.05);双基因组Survivin mRNA表达(0.13±0.02)明显低于Survivin单基因组(0.17±0.01),差异有统计学意义( F=245.647, P<0.05)。Western blot检测结果双基因组对NRP-1和Survivin蛋白的表达抑制率分别为67.41%和79.24%,与单基因组比较均有统计学意义( F=129.354、216.411, P<0.05)。体内抑瘤实验证实,与NRP-1单基因干扰组[(0.628±0.013) cm 3]、Survivin单基因干扰组[(0.601±0.301) cm 3]比较,双基因干扰组[(0.205±0.002) cm 3]瘤体积生长明显受到抑制,差异有统计学意义( F=49.214, P<0.05),抑瘤率为81.71%。TUNEL实验表明双基因干扰组凋亡指数[(49.84±1.98)%],显著高于NRP-1单基因组[(21.53±2.01)%, P<0.05]和Survivin单基因组[(19.91±2.11)%],差异有统计学意义( F=254.130, P<0.05)。 结论:同时表达两个不同基因的shRNA质粒载体转染鼻咽癌细胞后,可同时敲降NRP-1和survivin基因表达,与单个基因沉默比较,可以更好的促进细胞凋亡,抑制细胞生长增殖。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
-
Musashi RNA结合蛋白2通过Wnt/β-catenin信号通路对肝癌细胞增殖的影响
编辑人员丨5天前
目的:探究Musashi RNA结合蛋白2(MSI2)如何通过Wnt/β-catenin信号通路发挥调控肝癌细胞增殖的作用。方法:通过转染短发夹RNA(shRNA)抑制MSI2表达,将细胞分为转染对照质粒(sh-Ctrl)组和sh-MSI2组。MSI2过表达实验中将细胞分为对照组(Vector组,转染空白质粒Vector)和过表达组(MSI2组,转染MSI2重组质粒)。CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖。蛋白质印迹法检测干预MSI2后β-catenin、转录因子7(TCF7)和淋巴增强因子1(LEF1)的表达。Rescue回复实验中将细胞分为MSI2+sh-Ctrl组(同时转染MSI2重组质粒和sh-Ctrl质粒)和MSI2+sh-β-catenin组(同时转染MSI2重组质粒和sh-β-catenin质粒)。在过表达MSI2的基础上敲低β-catenin进行肝癌细胞增殖能力检测。结果:sh-MSI2组HepG2和MHCC97H细胞的增殖率均低于sh-Ctrl组,差异具有统计学意义( P<0.05)。MSI2组的SMMC-7721和MHCC97L细胞增殖率均高于Vector组,差异具有统计学意义( P<0.05)。克隆形成实验结果显示,与sh-Ctrl组相比,sh-MSI2组的HepG2细胞克隆数量[(129.7±6.5)比(286.0±12.8)]和MHCC97H细胞克隆数量[(134.0±6.7)比(248.0±14.1)]均减少,差异具有统计学意义( P<0.05);与Vector组相比,MIS2组的SMMC-7721细胞克隆数量[(242.0±5.6)比(135.3±8.7)]和MHCC97L细胞克隆数量[(308.0±9.0)比(149.7±5.9)]均增加,差异具有统计学意义( P<0.05)。sh-MSI2组HepG2和MHCC97H细胞中β-catenin、TCF7和LEF1 mRNA和蛋白的表达均低于sh-Ctrl组,组间比较差异具有统计学意义(均 P<0.05)。相反,与Vector组相比,MSI2组SMMC-7721和MHCC97L细胞的β-catenin、TCF7和LEF1 mRNA和蛋白表达水平均增加,差异均具有统计学意义( P<0.05)。与MSI2+sh-Ctrl组相比,MSI2+sh-β-catenin组细胞增殖能力下降,差异具有统计学意义( P<0.05)。平板克隆实验显示,MSI2+sh-β-catenin组细胞克隆形成数量少于MSI2+sh-Ctrl组[(138.3±7.0)比(246.3±8.0), P=0.028]。 结论:MSI2通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞增殖,导致肿瘤进展。
...不再出现此类内容
编辑人员丨5天前
