细胞抗酸碱机制是一个重要的分子生物学问题,也是当前国际上非常活跃的研究前沿领域.大肠杆菌的抗酸系统中,与代谢相关的抗酸机制是利用氨基酸脱羧酶消耗氨基酸特定的氢离子,产生胺类和CO2,最终提高pH值.周质空间的抗酸机制,主要是依靠分子伴侣来保护周质空间中蛋白质.细菌二元调控系统可以感知极端pH环境等外界刺激,激活或抑制靶基因的表达,使细胞做出应答.非编码小RNA的抗酸途径则通过增加RpoS或者降低H-NS的翻译来实现.关于大肠杆菌抗碱机制的研究甚少,至今只发现gadC、rpoS、nhaA和tnaA四个基因可能帮助大肠杆菌细胞耐受极碱环境.揭示大肠杆菌抗酸碱途径的生物学机制,对人肠道致病菌的治疗和预防都有着积极的作用,也能为生物医药的研究提供可靠的分子依据和新药开发的新靶点.

[目的]微生物活动是引起食品腐败的主要原因, 研究食品腐败菌的腐败作用调控机制对于保证食品的质量和安全具有重要意义.荧光假单胞菌是一种代表性的食品腐败菌, 本文旨在研究RNA聚合酶的选择性sigma因子Rpo S在荧光假单胞菌致腐败过程中的作用.[方法]运用同源重组的方法构建荧光假单胞菌冷藏鱼分离株的rpo S基因缺失突变株, 比较野生型和突变株暴露于不同胁迫条件下的存活率;通过液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 分析野生型和突变株产生高丝氨酸内酯类 (AHLs) 群体感应信号分子的种类和含量;检测野生型和突变株接种于灭菌三文鱼汁后4°C贮存过程中的菌落总数和挥发性盐基氮的生成量.[结果]成功构建了荧光假单胞菌rpo S基因缺失突变株.rpo S基因的缺失导致荧光假单胞菌对10 mmol/L H2O2和15％乙醇的耐受性显著降低, 对150μg/m L结晶紫和175 mmol/L醋酸的耐受性有一定程度增强, 不影响其对47°C和20％Na Cl的耐受性.荧光假单胞菌在rpo S基因缺失突变后长链信号分子C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL的含量增加.在灭菌三文鱼汁中的腐败活性检测表明rpo S基因缺失可导致荧光假单胞菌挥发性盐基氮的生成量显著降低.[结论]荧光假单胞菌的Rpo S不仅调节细菌对多种胁迫条件的耐受性, 还影响AHL群体感应和腐败活性.

目的 检测鼠伤寒沙门菌S025△rpoN、△rpoS、△csgA和△bcsA缺失株生物被膜形成能力和对药物敏感性的差异,研究生物被膜及其成分对细菌耐药性的影响. 方法 运用试管法检测生物被膜,药敏试验、最小抑菌浓度(MIC)法和最小杀菌浓度(MBC)法检测细菌对药物的敏感性. 结果 与野生株相比,△rpoN缺失株生物被膜形成能力增强,但对抗生素的敏感性没有发生改变,△rpoS和△csgA缺失株丧失生物被膜形成能力,△bcsA缺失株生物被膜形成能力下降,△rpoS、△csgA和△bcsA缺失株对头孢噻肟、美福仙、四环素、强力霉素和庆大霉素的敏感性提高,且△csgA缺失株抑菌圈直径大于△bcsA缺失株,表明生物被膜形成提高了细菌的耐药性.庆大霉素MBC结果显示,野生株和△rpoN为6.25 μg/ml,而△rpoS、△csgA和△bcsA分别为1.56 μg/ml、1.56 μg/ml和3.125 μg/ml,表明生物被膜形成提高抗生素的杀菌浓度. 结论 沙门菌形成生物被膜能提高细菌的耐药性,且卷曲菌毛的作用更为重要.

[背景]苯乙醇(2-Phenylethanol,2-PE)是一种具有玫瑰香气味的高级香料添加剂,被广泛应用于香水、化妆品、食品和医药等领域.目前,利用工程菌合成苯乙醇有很好的应用前景.我们分离到一株肠杆菌(Enterobactersp.)CGMCC 5087,其可以通过苯丙酮酸途径合成2-PE.然而该菌的生长受到不同环境因素导致的胁迫,进而影响苯乙醇的产量.RpoS作为一种稳定期σ因子和压力应答过程中的主要调节因子,在细菌抗环境胁迫生长中起重要作用.[目的]阐明肠杆菌CGMCC 5087中rpoS基因在多种环境胁迫中的作用,掌握该菌在不同环境胁迫下的生物学特性.[方法]使用CRISPR基因编辑技术敲除rpoS基因,通过质粒表达系统构建互补菌株,检测rpoS基因缺失株ArpoS与野生型WT菌株和互补菌株△rpoS(rpoS)在高渗透压、高温、低pH和氧化应激环境下的生长情况,并进行统计学分析.[结果]rpoS基因的缺失显著降低了肠杆菌CGMCC 5087的生长.在5％NaCl和pH 5.0胁迫条件下,rpoS基因的缺失导致肠杆菌CGMCC 5087的耐受性显著降低.在42℃高温条件下,rpoS基因的缺失导致肠杆菌CGMCC 5087在对数期的耐受性显著降低,而在衰退期的耐受性增强.1 mmol/L H2O2氧化胁迫条件下,rpoS基因的缺失导致肠杆菌CGMCC 5087的延滞期延长,而进入稳定期后rpoS基因突变株耐受性较野生型菌株明显增强.[结论]在肠杆菌CGMCC 5087中,RpoS在抵抗多种环境压力中均具有重要作用,而且在菌株不同的生长时期对于环境胁迫的应答也有所不同,为进一步了解肠杆菌CGMCC 5087的生物学特性、掌握RpoS在肠杆菌CGMCC 5087合成苯乙醇过程中的作用机制提供基础.

[背景]血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱等生物碱是我国二类新兽药博落回散和博普总碱散的主要成分,具有广泛的药理作用.[目的]研究亚抑菌浓度血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱对肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)主要外膜蛋白及其调控基因和Ⅱ型毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,T-A)系统基因表达的影响,初步探讨博落回生物碱对ExPEC细菌生理活动影响的可能机制.[方法]比较不同Ⅱ型T-A系统基因yafON、hicAB、prlF-yhaV缺失的ExPEC对血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱及抗生素的最小抑菌浓度;在1/2 MIC亚抑菌浓度血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱条件下,比较它们对ExPEC野生型(wild type,WT)菌株和外膜蛋白tolC缺失菌株(ΔtolC)的不同外膜蛋白基因ompC、ompX、tolC、ompF和调控基因 acrR、rob、marR、rpoS、soxS 表达的影响,以及对 T-A 系统基因 yafON、hicAB、prlF-yhaV表达的影响.[结果]T-A系统hicAB和prlF-yhaV缺失菌株对氯霉素的敏感性提高2-4倍,而且hicAB缺失菌株对血根碱的敏感性也提高2倍;1/2 MIC白屈菜红碱显著促进WT和ΔtolC菌株的ompX和tolC基因表达,而血根碱抑制WT菌株tolC基因的表达;在ΔtolC菌株中1/2 MIC血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱不同程度地促进ompX和ompC的基因表达,而对ompF存在着不同程度的抑制;1/2 MIC血根碱和白屈菜红碱显著促进WT和ΔtolC菌株的marR基因表达,并且血根碱还可以促进rpoS基因的表达.1/2 MIC原阿片碱显著降低WT菌株的yafN基因表达,而显著增加ΔtolC菌株的yafN基因表达水平;1/2MIC血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱不同程度地抑制WT菌株hicA和hicB基因表达,而促进ΔtolC菌株hicA和hicB 的基因表达;1/2 MIC血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱不同程度地促进WT和ΔtolC菌株的prlF基因表达,而血根碱显著抑制yhaV基因表达.[结论]Ⅱ型T-A系统和外膜蛋白参与ExPEC对不同生物碱的应激反应,外膜蛋白TolC的完整性对于T-A系统参与细菌应激具有一定的影响,并且其机制可能存在不同.

为了研究藻酸盐裂解酶(AlgL)对高黏液型肺炎克雷伯杆菌(HvKP)生物被膜和细菌因子RpoS基因的影响,从临床送检的痰液样本中分离出30株肺炎克雷伯杆菌(KP).采用全自动快速微生物质谱检测系统VITEK进行菌种鉴定,通过药敏试验进行耐药分析,拉丝试验阳性的菌株确定为HvKP;采用半定量结晶紫染色法进行细菌生物被膜半定量检测;用聚合酶链反应(PCR)检测RpoS基因的表达情况.试验发现,AlgL对HvKP生物被膜的形成有显著性抑制作用.本研究为AlgL在临床上用于治疗HvKP提供了研究基础.

病原微生物及其耐药性是全球公共卫生的重要问题.众多人兽共患病原菌可通过食品产业链传播给人,同时耐药性使得感染更难治疗,增加了疾病传播和死亡的风险.从分子水平上研究病原体的变异规律、毒力及其致病机制有助于寻找新的药物靶点、研制新的药物.DNA聚合酶Ⅳ(polymerase Ⅳ,Pol Ⅳ)是γ家族聚合酶中的重要成员,广泛分布在原核生物、真核生物和古细菌3个生命域.Pol Ⅳ具有跨损伤DNA合成的能力,不仅在SOS反应(SOS response)和RpoS调控下响应DNA损伤,还参与细菌抗生素抗性及适应性的获得,在细菌中发挥着至关重要的作用.本文综述了近年来细菌Pol Ⅳ相关研究,回顾了其遗传特征、结构特征、表达调控及对细菌适应性的影响,并且讨论了 Pol Ⅳ作为潜在药物靶点的可行性.