对1例蓝氏贾第鞭毛虫感染者进行虫种分子鉴定并分析其感染来源.收集患儿与其父母、保姆的新鲜粪样,碘液染色后镜检,提取粪样DNA,采用巢式PCR扩增贾第虫磷酸丙糖异构酶(tpi)、谷氨酸脱氢酶(gdhi)、β-贾第素(bg)基因并测序,通过BLAST、ChromasPro和MEGA 11.0等软件对基因序列进行系统进化分析并判断其集聚体类型.结果显示,镜下可见患儿粪样中有贾第虫滋养体和包囊.巢式PCR均扩增出约500 bp的条带,与贾第虫属tpi、gdh、bg基因片段一致,确认该患儿为贾第虫感染;患儿父母和保姆均无腹泻症状,但在其父亲粪样中发现贾第虫包囊,结合巢式PCR与测序结果分析,其父为贾第虫带虫者.基因比对分析结果显示,患儿父子二人粪样扩增出的tpi、gdh、bg基因序列一致性分别为99.8％、100％和98.5％,其中tpi基因序列与贾第虫集聚体AⅡ型(GenBank登录号:LC183963)的序列一致性分别为100％、99.8％,gdh基因序列与贾第虫集聚体AⅡ型(GenBank登录号:KF843931)的序列一致性分别为99.6％、100％,患儿bg基因序列与集聚体AⅢ型(GenBank登录号:LC183968)的序列一致性为99.2％,患儿父亲bg基因序列与集聚体AⅡ型(GenBank登录号:LC183975)的序列一致性为100％.系统进化树分析结果显示,患儿与其父亲所感染的贾第虫均与集聚体A型虫株聚在一支,且以tpi和gdh为靶基因进行亚型分析均与贾第虫集聚体AⅡ型聚在一支.由此判断患儿为贾第虫集聚体AⅡ型感染,且可能为家庭内部传播导致的家庭聚集性感染.

以蓝氏贾第鞭毛虫中国C2株基因组DNA为模板,PCR扩增蓝氏贾第鞭虫核苷二磷酸激酶(GlNDPK)基因编码序列,连接至pET28a质粒,转化至大肠埃希菌(Escherichiacoli) JM109,挑取阳性克隆进行鉴定与测序.将pET28a-GlNDPK转化至E.coli BL21 (DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况.用8 mol/L尿素溶解包涵体并收集上清,镍离子亲和层析进行纯化,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性.结果显示,PCR扩增获得了长度约1 200 bp的蓝氏贾第鞭毛虫中国C2株GlNDPK基因编码序列.构建的重组质粒pET28a-GlNDPK经PCR鉴定、单酶切鉴定和测序,结果均与预期相符.SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体的形式表达,相对分子质量(Mr)约为40 000,与预期结果大致一致.Western blotting结果显示,该重组蛋白可被His标签抗体识别.提示获得了蓝氏贾第鞭毛虫中国C2株GlNDPK基因编码序列及其重组表达蛋白.

目的 建立基于重组酶介导的等温扩增技术(RAA)的蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测方法,并评价其检测敏感性和特异性.方法 选择蓝氏贾第鞭毛虫β-贾第素(β-giardin)基因作为检测靶基因,设计、合成特异性检测引物及荧光探针,建立荧光RAA检测体系.分别以不同拷贝数的重组质粒(含β-giardin基因靶序列)和不同浓度蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以蓝氏贾第鞭毛虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板进行扩增,评价其检测特异性.结果 成功建立了蓝氏贾第鞭毛虫荧光RAA检测方法,其可在等温(39℃)条件下实现对靶基因片段的快速、特异性扩增(20 min内).分别以重组质粒和蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板,该方法的检测敏感性可达102拷贝/μL和1 pg/μL;以日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板的RAA检测结果均为阴性,具备较好特异性.结论 建立了一种操作简便、敏感、特异的可用于蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测的荧光RAA方法.