对1例蓝氏贾第鞭毛虫感染者进行虫种分子鉴定并分析其感染来源.收集患儿与其父母、保姆的新鲜粪样,碘液染色后镜检,提取粪样DNA,采用巢式PCR扩增贾第虫磷酸丙糖异构酶(tpi)、谷氨酸脱氢酶(gdhi)、β-贾第素(bg)基因并测序,通过BLAST、ChromasPro和MEGA 11.0等软件对基因序列进行系统进化分析并判断其集聚体类型.结果显示,镜下可见患儿粪样中有贾第虫滋养体和包囊.巢式PCR均扩增出约500 bp的条带,与贾第虫属tpi、gdh、bg基因片段一致,确认该患儿为贾第虫感染;患儿父母和保姆均无腹泻症状,但在其父亲粪样中发现贾第虫包囊,结合巢式PCR与测序结果分析,其父为贾第虫带虫者.基因比对分析结果显示,患儿父子二人粪样扩增出的tpi、gdh、bg基因序列一致性分别为99.8％、100％和98.5％,其中tpi基因序列与贾第虫集聚体AⅡ型(GenBank登录号:LC183963)的序列一致性分别为100％、99.8％,gdh基因序列与贾第虫集聚体AⅡ型(GenBank登录号:KF843931)的序列一致性分别为99.6％、100％,患儿bg基因序列与集聚体AⅢ型(GenBank登录号:LC183968)的序列一致性为99.2％,患儿父亲bg基因序列与集聚体AⅡ型(GenBank登录号:LC183975)的序列一致性为100％.系统进化树分析结果显示,患儿与其父亲所感染的贾第虫均与集聚体A型虫株聚在一支,且以tpi和gdh为靶基因进行亚型分析均与贾第虫集聚体AⅡ型聚在一支.由此判断患儿为贾第虫集聚体AⅡ型感染,且可能为家庭内部传播导致的家庭聚集性感染.

目的 克隆刚地弓形虫磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)基因,原核表达和纯化蛋白,研究其对弓形虫感染小鼠的免疫保护作用.方法 抽提弓形虫速殖子总RNA,利用PCR技术扩增刚地弓形虫TPI基因,构建重组原核表达载体TPI/pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达,镍亲和层析法纯化目的蛋白.将与佐剂乳化后的TPI蛋白对小鼠颈背部多点皮内免疫,间隔2周,连续免疫4次,最后一次为加强免疫,同时设置佐剂对照组与正常对照组.尾静脉采血检测小鼠血清抗体效价.以400个弓形虫速殖子/只接种小鼠腹腔,观察记录各组小鼠的生存率.结果 成功扩增到弓形虫TPI基因,构建原核表达载体TPI/pET-28a(+),获得纯化的TPI蛋白,TPI免疫4次后的小鼠血清抗体效价可达1:100000以上,且生存期显著高于佐剂对照组与正常对照组.结论 弓形虫TPI蛋白对弓形虫感染小鼠具有一定的免疫保护作用,为研究弓形虫疫苗奠定了理论基础.

[目的]将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(RpiB)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化.[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增RpiB基因,经酶切连接表达载体pET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况.通过LC-MS-MS验证重组酶活性.[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 kDa左右.优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多.重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19％.[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的RpiB酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性.

目的 对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆 、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果 构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃ 经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×103.结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达.

通过PCR克隆了一种来自枯草芽孢杆菌str.168菌株的甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因(BSMPI-2),利用pET-28a载体转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株.经IPTG诱导实现了BSMPI-2蛋白的表达,经过亲和层析纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证,证实目的蛋白分子量约3.54× 104,BSMPI-2以L-核糖为底物时的最适反应条件为pH 8.0、60℃、外源添加0.5 mmol/L Co2+,该酶催化2h可将29％的L-核糖异构为L-核酮糖.

目的 调查长春地区猪十二指肠贾第鞭毛虫(简称贾第虫)感染的分子流行病学特征.方法 选择长春地区两个猪场,随机采集60份猪粪便样品,根据贾第虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,TPI)基因设计巢式PCR引物,以提取的猪粪便基因组DNA为模板进行巢式PCR扩增,PCR产物经测序及序列比对,并建立贾第虫系统进化树.结果 60份样品中,27份为阳性,阳性率为45％(27/60),基因型均为人兽共患型集聚体A.结论 长春地区两个猪场存在较严重的贾第虫感染,基因型均为集聚体A,有较大的散播风险,需加强猪场卫生监督管理,以避免疫病流行.

以蓖麻为材料,在现蕾期前持续铅锌胁迫,分析此过程中植株叶片可溶性糖和淀粉含量变化及糖代谢关键酶基因表达特点.结果 表明:叶片可溶性糖含量在0.0015 mol·kg-1单一pb2+胁迫处理植株中最高,其次是0.0005 mol·kg-1 pb2++0.0015 mol·kg-1Zn2+复合胁迫处理植株;叶片淀粉含量在0.0030 mol·kg-1单一Zn2+处理植株中最高,其次是浓度0.0015 mol·kg-1单一Pb2+胁迫处理的植株.铅锌复合胁迫处理植株叶片中可溶性糖和淀粉累积量均高于对照,且当铅锌单一胁迫浓度分别为0.0020和0.0060 mol·kg-1时,可溶性糖含量较对照无显著差异,淀粉含量较对照存在显著差异,同时,差异基因在淀粉和蔗糖代谢途径、糖酵解/糖异生途径中富集最多.铅胁迫下,蔗糖磷酸合成酶(SPS)、β-呋喃果糖苷酶(INV)、β-淀粉酶、果糖-1,6-二磷酸酶Ⅰ类(FBP)、6-磷酸果糖激酶-1 (PFK-1)、磷酸丙糖异构酶(TPI)等关键酶基因表达水平发生变化;锌胁迫下1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE1)、蔗糖合成酶(SS)、颗粒结合淀粉合成酶(WAXY)、α-与β-淀粉酶、果糖-1,6-二磷酸酶Ⅰ类(FBP)、葡萄糖磷酸变位酶(PGM)、己糖激酶(HK)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)、丙酮酸激酶(PK)等关键酶基因表达水平发生变化.即铅、锌胁迫下糖代谢基因差异表达,且此时可溶性糖含量较对照无显著差异,淀粉含量较对照存在显著差异,这也说明重金属铅锌胁迫影响糖代谢平衡使得植株生长期延长.

目的 了解广西地区艾滋病病毒感染/艾滋病(HIV/AIDS)患者蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)感染情况及基因型分析. 方法 收集广西地区HIV/AIDS患者和健康者粪样,镜检后提取粪样中贾第虫DNA,并采用巢式PCR方法扩增贾第虫磷酸丙糖异构酶基因(triosephosphate isomerase,TPI),对阳性结果进行测序和BLAST比对分析,并构建进化树. 结果 共收集285例HIV/AIDS患者粪样,其中男性216例,女性69例,年龄21～85岁,其中130例曾接受抗逆转录病毒治疗.HIV/AIDS患者粪样镜检贾第虫阳性8份,阳性率为2.8％;健康者粪样303份,无贾第虫感染,两者差异有统计学意义(P＜0.01).巢式PCR扩增阳性粪样,发现530 bp左右有一条特异性条带.经测序分析,有7份贾第虫样品为人兽共患集聚体B型,其中6份与已报到的人源分离株TPI基因序列一致性为100％.另外1份为集聚体C型,且该分离株与已报到的人源贾第虫集聚体C型基因序列一致性为100％. 结论 广西地区部分HIV/AIDS患者感染贾第虫,其基因型主要为集聚体B型.

目的 对1株菌落形态近似艰难梭菌的未知菌株进行鉴别、系统进化及药敏分析.方法 利用艰难梭菌选择性分离培养方法从健康宠物狗粪便中分离纯化菌种.利用艰难梭菌抗原胶乳凝集快速检测试剂盒和艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,Tpi)编码基因tpi PCR扩增进行生化和分子鉴别.PCR扩增未知菌株的16S rDNA基因、测序进行分子鉴定;利用MEGA 7.0等软件构建系统进化树对其进行系统进化分析,利用琼脂糖稀释法对该菌株进行药物敏感性试验.结果 艰难梭菌选择性培养方法获得的菌落形态疑似艰难梭菌的未知菌株经生化以及分子鉴别后并非艰难梭菌.16S rDNA序列比对和系统进化分析表明:该菌株系与艰难梭菌同属的索氏梭菌(Clostridium sordelli),与艰难梭菌有较近的亲缘关系,对氨苄西林、克林霉素以及莫西沙星敏感.结论 利用艰难梭菌选择性分离培养方法在健康宠物狗粪便中获得菌落形态与艰难梭菌相似的未知菌株为索氏梭菌,其耐药谱型与艰难梭菌差异较大.

法尼醇(Farnesol,FOH)是由焦磷酸异戊烯基(IPP)和焦磷酸二甲基烯丙基(DMAPP)合成的法尼酰基焦磷酸盐(FPP)去焦磷酸化作用生成的.在类球红细菌中IPP和DMAPP是由MEP途径生成,而完整的MEP途径需要消耗大量的辅因子NADPH,增加胞内NADPH的量有可能强化FOH的合成.文中从增加NADPH的生成和降低NADPH的消耗这两个策略出发,分别干扰了编码6-磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的表达,同时强化了磷酸戊糖途径中6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因(zwf)和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因(gnd)的表达.实验结果表明,经改造的菌株NADPH含量显著增加,干扰菌株中菌株RSpgii的产量较高,为3.91 mg/g,在过表达的菌株中同时过表达zwf和gnd基因的重组菌株(RSzg)的FOH产量提高到了3.43 mg/g.为了获得FOH产量更高的菌株,以RSpgii为出发菌株,分别与zwf和gnd组合调控,获得的菌株RSzgpi的产量达到了最高量为4.48 mg/g,是出发菌株RS-GY2产率的2.24倍.