丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是一种由须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)产生的大环内酯类抗生素,属于绿色环保型生物农药,在防治害虫和粮食储藏方面具有很高的应用价值.野生型菌株产量较低,限制了丁烯基多杀菌素的应用,高产菌株的育种和发酵工艺优化是提升丁烯基多杀菌素产量的有效方法.对近年来遗传育种提高丁烯基多杀菌素的方法进行总结,分析须糖多孢菌的碳、氮、磷酸盐代谢通路改造及转录调控对丁烯基多杀菌产量的影响,展望异源表达进行菌株育种的前景,以期对丁烯基多杀菌素高产菌株的构建和优化提供有价值的参考.

本文研究了不同碳源对须糖多孢菌生长以及丁烯基多杀菌素生物合成的影响,通过寻找优势碳源优化发酵培养基配方,促进须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成.试验共设11个处理,1个对照,通过单因素试验比较不同处理组菌体OD600值和丁烯基多杀菌素产量,筛选获得最优碳源及其发酵培养基配方.结果 表明,除可溶性淀粉和木糖外,须糖多孢菌在9种碳源中都能进行生长,对不同构型碳源显示较好的利用率.在以半乳糖、葡萄糖、果糖和甘露糖作为碳源时具有较好的生长速率,而以甘露糖为碳源时能显著促进丁烯基多杀菌素的合成.选择甘露糖最佳添加浓度为5 g/L,须糖多孢菌最高菌体浓度和丁烯基多杀菌素产量分别是初始配方条件的1.32倍和1.78倍,显著提高了丁烯基多杀菌素的产量.上述结果为培养基碳源对丁烯基多杀菌素生物合成影响机制的研究及丁烯基多杀菌素大规模工业化发酵生产提供了科学依据和新的技术途径.

fcl基因编码的GDP-岩藻糖合成酶(GDP fucose synthetase,GFS),能催化由GDP-D-甘露糖合成GDP-L-岩藻糖过程中的两步差向异构酶和还原酶反应;还参与氨基糖和核糖的生物合成,是调控生物体糖代谢、核苷酸代谢的关键酶之一.通过前期基因组测序表明须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona中存在fcl基因.利用基因工程技术构建了fcl基因的过表达菌株S.pogona-fcl和敲除菌株S.pogona-△fcl.结果 表明该基因对菌株生长发育、蛋白表达及其转录水平、杀虫活性、丁烯基多杀菌素的生物合成均存在影响.经HPLC分析显示,S.pogona-Afcl的丁烯基多杀菌素产量增加为野生型菌株的130％,S.pogona-fcl的丁烯基多杀菌素产量降低了25％.生测结果显示,与野生型菌株相比S.pogona-Afcl对棉铃虫的杀虫活性明显增强,而S.pogona-fcl的杀虫活性降低.利用扫描电镜观察发现,S.pogona-Afcl菌丝体表面出现褶皱,呈现短棒状,S.pogona-fcl菌丝形态与野生型菌株一致.以上结果表明,fcl基因的敲除影响菌丝体的生长发育,能促进丁烯基多杀菌素的生物合成和增强杀虫活性,该基因的过表达抑制了丁烯基多杀菌素的生物合成和降低了杀虫活性.SDS-PAGE结果表明,三株菌株在96 h时蛋白表达差异最为明显.对差异蛋白通过实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,三菌株蛋白的转录水平存在显著表达差异.通过研究结果构建了网络代谢调控图,分析fcl基因对须糖多孢菌生长发育及丁烯基多杀菌素生物合成代谢调控网络途径的影响,初步构建了fcl基因调控的代谢途径,为揭示丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制及相关后续研究提供了实验依据.

[目的]须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)基因组中存在一些双组分系统(two-component system,TCS),包括一个LytR调控因子和一个PdtaR转录抗终止调节因子,我们旨在通过基因工程技术改造分析这两个双组分系统蛋白在须糖多孢菌中的作用.[方法]本研究利用融合PCR和属间接合转移技术,构建了 S.pogona-ΔlytR和 S.pogona-PdtaR工程菌株,研究它们对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的影响.[结果]HPLC检测和质谱鉴定表明,与原始菌相比,S.pogona-ΔlytR中丁烯基多杀菌素产量有所提高,而S.pogona-PdtaR中产量下调,表明lytR和pdtaR对丁烯基多杀菌素生物合成有负调控作用.此外,生长曲线测定和表型分析结果表明,S.pogona-ΔlytR和S.pogona-PdtaR对须糖多孢菌的生长发育和孢子形成也产生了 一定的影响.[结论]本研究为进一步阐明丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制奠定了理论基础.