为探究中国绿水螅(Hydra sinensis)体内有或无共生藻是否影响水螅宿主对聚苯乙烯纳米颗粒(Poly-styrene nanoparticles,PS NPs)的耐受性,研究首先对绿水螅野生型品系(体内有共生藻)及绿水螅无藻品系(体内无共生藻)分别进行PS NPs(粒径20 nm)48h急性毒理实验,结果显示野生型品系48h半致死浓度(3.36x102 mg/L)明显高于无藻品系(1.39×102 mg/L),这表明与无藻品系相比,野生型品系对PS NPs具有较强的耐受性.随后采用含75 mg/L PS NPs的培养液对绿水螅野生型品系及无藻品系处理48h后分别进行转录组分析(对照组PS NPs浓度为0mg/L),在野生型品系的PS NPs处理组与对照组间共筛选到1532个差异表达基因(Differen-tially expressed genes,DEGs),其中763个DEGs表达上调,769个DEGs表达下调;而无藻品系的PS NPs处理组与对照组间共筛选到1079个DEGs,其中476个DEGs表达上调,603个DEGs表达下调.基于PS NPs胁迫下无藻品系的DEGs显著富集的病态指征相关的14个KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路中,有9个通路包含的DEGs全部表达上调;而基于PS NPs胁迫下野生型品系的DEGs显著富集的病态指征相关的21个KEGG代谢通路中,只有1个通路包含的DEGs全部表达上调.由此可见,PS NPs胁迫下无藻品系病态指征的激活水平显著高于野生型品系,此现象从分子水平证明了野生型品系对PS NPs胁迫的耐受性强于无藻品系.此外,从PSNPs胁迫下无藻品系显著富集的免疫应答相关KEGG代谢通路中的21个DEGs全部表达上调,而从PS NPs胁迫下野生型品系显著富集的免疫应答相关KEGG代谢通路中的27个DEGs仅约一半表达上调,说明PS NPs胁迫下野生型品系免疫应答的激活水平明显低于无藻品系,这反映了野生型品系对PS NPs的免疫应答敏感性低于无藻品系.总之,绿水螅两个品系在对PSNPs的免疫应答敏感性上的差异应是两个品系对PS NPs胁迫耐受性差异的分子基础;而相对于绿水螅无藻品系而言,野生型品系对PS NPs具有较低的免疫应答敏感性可能与水螅-单细胞藻共生体系中水螅宿主为维持与共生藻的共生关系而进行的免疫水平调整(即水螅宿主为"容留"共生藻而"调低"了对外来异物的免疫水平)的机制相关.研究为探讨纳米级塑料颗粒的生物毒性及分子机理提供了基础数据.

目的:探究强光及高温诱发白化的中国绿水螅共生细菌多样性的特征.方法:以光照强度2000 Lux和温度25℃条件为对照,分别在强光胁迫(6000Lux,25℃)、高温胁迫(2000Lux,33℃)以及强光和高温联合胁迫(6000Lux,33℃)等3种条件下进行诱导中国绿水螅白化的实验.白化实验进行到21天后,采用对单个水螅细胞中的共生藻进行计数的方法检测绿水螅白化的程度,同时通过16SrDNA高通量测序的方法分析绿水螅共生细菌多样性及丰度变化.结果:在强光胁迫、高温胁迫及强光和高温联合胁迫下绿水螅体内共生藻数量均显著减少(P＜0.05).强光胁迫下绿水螅共生细菌中蓝细菌门(Cyanobacteria)的丰度上升,而在强光和高温联合胁迫下绿水螅共生细菌中不但蓝细菌门的丰度上升,绿硫菌门(Chlorobi)的丰度也明显提高.此外,KEGG富集分析结果表明发生白化的绿水螅共生细菌与亚油酸、类胡萝卜素及甜菜红色素等抗氧化剂的合成和代谢相关.结论:蓝细菌和绿硫菌的光合作用产物有可能被水螅宿主所利用、以弥补水螅宿主由于共生藻的减少带来的营养缺乏;强光和高温胁迫下绿水螅出现白化现象后共生细菌多样性朝有利于提高水螅宿主抗氧化能力的方向发生变化.

研究对中国绿水螅共生绿藻的核18S rRNA基因全长序列及其叶绿体9个基因(atpA、chlB、chlN、petA、psaB、psbA、psbC、psbD及rbcL)片段序列进行了克隆和测序,并基于18S rRNA基因序列及叶绿体9个基因序列的整合数据分别通过最大似然法(Maximum-likelihood)和贝叶斯分析(Bayesian inference)对中国绿水螅(Hydra sinensis)共生单细胞绿藻的系统发生地位进行了探讨.系统发生表明:(1)中国绿水螅共生绿藻属于共球藻纲(Trebouxiophyceae)小球藻目(Chlorellales),但不属于其中的小球藻属(Chlorella);(2)来源于草履虫、水螅、地衣及银杏的共生绿藻均在共球藻纲支系,而来源于蛙类和蝾螈的共生绿藻属于绿藻纲(Chlorophyceae)支系.无论在共球藻纲支系还是在绿藻纲支系,不同来源的共生藻并没有排他性地聚为单系群而在系统树中与其他自由生活的绿藻混杂排列,来自不同宿主的共生绿藻没有共同起源.

为探讨中国绿水螅(Hydra sinensis)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)基因的起源及功能,研究采用RACE方法克隆了中国绿水螅APX基因的全长cDNA序列.该cDNA序列总长1357 bp, 包括5′非编码区107 bp, 3′非编码区146 bp及开放阅读框(Open reading frame, ORF) 1104 bp, 共编码367个氨基酸, 预测蛋白质分子量为40.79 kD.BLAST结果表明中国绿水螅APX蛋白同源序列绝大部分来自植物界; 通过最大似然法 (Maximum-likelihood)和贝叶斯分析(Bayesian inference)进行的系统发生分析显示植物界及动物界物种的 APX序列各自形成单系群.把APX基因ORF全长序列克隆到原核表达质粒pET-GST中, 重组质粒转化E. coli BL21 (DE3)菌株, IPTG诱导后成功表达重组融合蛋白GST-APX, 再使用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体用于APX蛋白的免疫印迹分析(Western blotting assay, WB).在不同光照时长梯度(光强度2000 lx,每天分别光照0、4h、8h、12h、16h、20h及24h)下培养中国绿水螅30d, 实时定量PCR (Quantitative real-time PCR, qPCR)及WB检测结果均表明光照时间较长时(每天光照12h以上)绿水螅APX表达呈现一定程度的上调.在长时间光辐射下水螅体内共生绿藻连续进行光合作用所累积的大量活性氧能够扩散到水螅细胞内, 此时水螅体内表达上调的APX可能参与清除其细胞内的活性氧.

受全球暖化及光辐射增强的双重胁迫,珊瑚礁主成分刺胞动物-微藻共生体白化(共生藻数量减少)日趋严重.在中国绿水螅(Hydra sinensis)对异常环境因子的响应前期研究中筛选到一个"高温(33℃)-强光(6 000 lx)"双胁迫参数组合能诱发绿水螅白化,进一步在其基础上探讨高温单胁迫、强光单胁迫及高温-强光双胁迫诱发中国绿水螅白化进程中其共生藻的数量动态、活性氧(超氧阴离子自由基及丙二醛两个指标)的积累及抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及过氧化物酶)活性的变化.结果显示,与高温单胁迫和强光单胁迫相比,高温-强光双胁迫下绿水螅共生藻数量下降幅度最高(双胁迫处理21 d后共生藻数量下降幅度接近90％);强光单胁迫下绿水螅仅在胁迫的起始阶段共生藻数量下降幅度略高于高温单胁迫,而其余时段均明显低于高温单胁迫;无论是单胁迫、还是双胁迫均导致绿水螅活性氧水平上调,但在强光单胁迫下绿水螅活性氧水平上调的起始时间明显早于高温单胁迫;在所有胁迫处理的中、后期绿水螅3种抗氧化酶活性动态总体趋势为上调,而在大部分时间段双胁迫条件下每种抗氧化酶活性高于单胁迫,并且强光单胁迫下绿水螅每种抗氧化酶活性上调的起始时间均早于高温单胁迫.综上所述,与高温单胁迫以及强光单胁迫相比,高温-强光联合胁迫显著加剧了绿水螅的白化程度,即高温胁迫及强光胁迫联合处理对绿水螅白化发生的促进具有协同效应;绿水螅对强光胁迫的响应较对高温胁迫的响应更敏感,但高温胁迫在促进绿水螅白化发生的进程中影响程度却大于强光胁迫,因此高温胁迫与强光胁迫之间在诱导绿水螅白化发生的作用方式上存在差异.