目的:探讨大电导钙激活钾离子通道［large conductance calcium-activated potassium channel，BK（Ca）］是否参与衰老小鼠耳蜗血管纹毛细血管周细胞（pericytes，PC）的迁移。方法:将C57BL/6J小鼠分为3月龄（ n=10）组和12月龄组（ n=10），听性脑干反应（ABR）检测各组听力阈值；免疫荧光检测各组耳蜗血管纹毛细血管PC上β-BK（Ca）通道和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达变化；透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察各组耳蜗血管纹PC的形态改变。细胞实验：原代培养耳蜗血管纹PC并鉴定；D-半乳糖（D-gal）制备细胞衰老模型，CCK8确定D-gal干预浓度；β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估细胞衰老水平；全细胞膜片钳技术记录PC上BK（Ca）通道激活电流变化；免疫荧光技术检测PC上β-BK（Ca）通道蛋白表达变化；划痕实验和Transwell实验检测2组细胞迁移侵袭能力；Western blot技术检测β-BK（Ca）通道和OPN蛋白表达水平。采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。 结果:动物实验：12月龄组小鼠较3月龄组ABR阈值升高（ t=12.66， P<0.01）；12月龄组小鼠耳蜗血管纹PC上β-BK（Ca）通道表达水平较3月龄组降低（ t=14.64， P<0.01），OPN表达升高（ t=20.73， P<0.01）；TEM中3月龄组PC与内皮细胞紧密相连，12月龄组PC与内皮细胞连接疏松或PC胞体从毛细血管壁分离。细胞实验：耳蜗血管纹原代培养的耳蜗血管纹PC阳性率在95%以上，15 mg/ml D-gal干预的PC较对照组的SA-β-gal染色细胞阳性率高，差异有统计学意义（ t=36.90， P<0.01）。与对照组PC相比，D-gal干预组全细胞膜片钳BK（Ca）通道电流减小（ t=12.18， P<0.05），β-BK（Ca）通道蛋白和荧光表达水平降低（ t=11.98， P<0.01； t=15.72， P<0.05），OPN蛋白表达升高（ t=18.53， P<0.01），PC迁移能力增加（ t=7.91， P<0.01； t=7.59， P<0.01）。D-gal干预后给予BK（Ca）通道特异性阻断剂Iberiotoxin（IBTX）可使OPN表达明显升高（ t=4.26， P<0.05），PC迁移能力增加（ t=5.88， P<0.01； t=21.97， P<0.01）。 结论:衰老小鼠耳蜗血管纹毛细血管PC迁移能力增加，β-BK（Ca）通道表达降低，给予BK（Ca）通道特异性阻断剂IBTX可使迁移能力增加，提示BK（Ca）通道可能参与衰老小鼠耳蜗血管纹毛细血管PC的迁移。

目的:探讨中电导钙激活钾离子通道(SK4)蛋白与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的相关性。方法:分析88例甲状腺乳头状癌患者的组织芯片，根据SK4免疫组织化学染色结果分为SK4阳性表达组(55例)和SK4阴性表达组(33例)，细胞实验小干扰RNA(siRNA)敲除SK4的甲状腺乳头状癌细胞为实验组，甲状腺乳头状癌细胞为对照组。采用 χ2检验分析SK4表达与临床病理特征之间的关系，采用Logistic回归模型分析甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移危险因素。通过Transwell细胞迁移和侵袭实验验证SK4对甲状腺乳头状癌细胞侵袭转移的作用。采用SPSS 22.0(IBM)和Graphpad prism 5.0软件分析。应用 χ2检验和Fisher精确概率法分析组间差异，建立Logistic二元回归模型进行单因素、多因素分析。 结果:88例甲状腺乳头状癌组织中SK4阳性者为55例，阳性率为62.5%。SK4在甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移中阳性表达率为73.3%(33/45)，SK4在各临床分期中阳性表达率为，Ⅰ期66.7%(24/33)，Ⅱ期23.1%(3/13)，Ⅲ期80.6%(25/33)，Ⅳ期50.0%(3/6)， χ2检验结果显示SK4的表达水平与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移、临床分期之间差异有统计学意义( χ2＝4.611、11.762， P<0.05)。SK4的表达与患者年龄、性别、T分期、肿瘤部位之间无统计学意义( χ2＝0.724、1.343、2.799、0.637， P>0.05)。Logistic回归分析结果显示SK4阳性和临床分期，是甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的独立危险因素( OR＝3.827、3.882， P<0.05)。SK4敲除后甲状腺乳头状癌细胞的侵袭及迁移能力的明显受到抑制，SK4敲除组侵袭及迁移能力低于对照组(224个细胞 比690个细胞；196个细胞比571个细胞； t＝185.900、138.600， P<0.01)。 结论:SK4的表达与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移中密切相关。

线粒体由内外两层膜封闭而成,其中线粒体内膜作用极为重要,呼吸链蛋白复合体附着于线粒体内膜,同时于此完成其生理功能.目前,线粒体内膜已鉴定出多种钾离子通道蛋白,如线粒体选择性钾离子通道,包括ATP依赖钾通道(mitoKATP)、电压依赖性钾通道(mitoKv 1.3)、小电导钙离子激活钾通道(mitoSKCa)、中电导钙离子激活钾通道(mitoIKCa)、大电导钙离子激活钾通道(mitoBKQ)、pH依赖钾离子通道(mitopH-sensitive K+ channels)以及TASK-3双孔钾通道(mitoTASK-3)[1-2].其中,Xu等[3]于2002年首次发现mitoBKCa在心血管疾病中扮演着极为重要的角色.随着对mitoBKCa研究的深入,发现mitoBKCa在细胞凋亡等多种生理、病理活动中也起着重要作用[4].笔者对mitoBKCa结构与功能研究的进展进行一个简要总结.

采用Real-time PCR、Western blot及免疫组化检测中电导钙激活钾离子通道蛋白(intermediate-conductance calcium-activated potassium channel protein,SK4/Kca3.1/KCNN4)在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)组织及细胞株中的表达情况,同时,对比研究SK4蛋白表达与PTC临床病理特征的关系.通过SK4特异性抑制剂(TRAM-34)下调SK4的表达后,采用CCK-8、平板克隆实验及Transwell实验分别检测SK4对PTC细胞株CGTHW-3增殖、集落形成及迁移能力的影响并分析其可能的分子机制.Real-time PCR、Western blot结果显示,SK4在PTC组织中的mRNA及蛋白表达量均明显高于癌旁组织(P＜0.01).免疫组化结果显示,SK4的阳性率明显高于正常甲状腺组织(P＜0.01),而SK4蛋白表达阳性率与PTC患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理特征之间并无显著统计学意义(P＞0.05).TRAM-34可通过阻断SK4通道抑制CGTHW-3细胞的增殖、集落形成能力及迁移能力.以上结果提示,SK4通道在PTC组织及细胞中高表达,参与调控PTC细胞的增殖及迁移过程,可能与PTC发病的分子机制有关.SK4有可能成为PTC新的治疗靶点.

目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1).方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用West?ern印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果.结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1.结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法.

目的 探讨抑制元件l沉默转录因子(REST)在宫颈鳞状细胞癌组织中表达及其对电导钙激活钾离子通道(KCa3.1)的影响.方法 收集宫颈鳞状细胞癌组织、癌旁组织和正常宫颈组织,采用免疫组化、qRT-PCR分别检测不同组织中REST的蛋白和mRNA表达量.Ch IP-qPCR检测REST在KCa3.1启动子区抑制元件1(RE1)位点处富集程度.结果 宫颈鳞状细胞癌、癌旁、正常宫颈组织中REST基因相对表达量分别为0.46±0.06、0.89±0.13、1.00±0.12;宫颈鳞状细胞癌中REST基因相对表达量较癌旁组织和正常宫颈组织分别下降48％、54％;宫颈鳞状细胞癌、癌旁、正常宫颈组织中KCa3.1基因表达量分别为2.14±0.35、1.18±0.21、1.00±0.13,宫颈鳞状细胞癌中KCa3.1基因表达量较癌旁组织和正常宫颈组织分别上升81％、114％.在宫颈鳞状细胞癌组织中REST的蛋白表达和mRNA转录水平较正常宫颈组织和癌旁组织下调(P均＜0.05).KCa3.1的表达量在宫颈鳞状细胞癌中较癌旁组织及正常宫颈组织增加(P均＜0.05).REST能与KCa3.1启动子区RE1位点结合,且宫颈鳞状细胞癌组织中REST在KCa3.1启动子RE1位点处的富集程度低于正常宫颈组织和癌旁组织(P均＜0.05).结论 REST通过与KCa3.1启动子RE1位点处结合负调控KCa3.1表达.REST表达下调降低了对KCa3.1基因表达的抑制,导致KCa3.1基因表达量上升,增强KCa3.1的活性,促进宫颈鳞状细胞癌的发生发展.

目的 探讨血管紧张素(Ang) (1-7)在肾纤维化过程中的保护作用与中电导钙激活钾离子通道(KCa3.1)的关系.方法 60只雄性小鼠随机分为5组:对照组(WT);血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)组:皮下注射AngⅡ[1.4 mg/(kg.d)];注射AngⅡ的同时给予以下药物干预:AngⅡ阻断剂洛沙坦(Losartan)组:皮下注射Losartan[40 mg/(kg.d)];Ang (1-7)组:皮下注射Ang(1-7) [0.14 mg/(kg.d)];血管紧张素转化酶2(ACE2)激动剂重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐(DIZE)组:皮下注射DIZE[10 mg/(kg.d)].连续给药4周后对相关指标进行检测.Masson染色法检测肾组织胶原沉积变化;Western blotting法检测肾组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和KCa3.1通道蛋白表达的变化.结果 与对照组相比,AngⅡ组小鼠肾组织内胶原沉积量明显增加(n=12,P＜0.01),表明肾纤维化模型复制成功.AngⅡ使肾组织Ⅰ、Ⅲ型胶原合成显著增多(n=6,P＜0.01),同时促进了肾组织KCa3.1通道蛋白的表达(P＜0.01),而Ang (1-7)及ACE2激活剂DIZE的应用抑制了肾组织内胶原沉积量、Ⅰ/Ⅲ型胶原合成及KCa3.1通道蛋白的表达(n=12或6,P＜0.01).结论 Ang (1-7)在肾纤维化过程中发挥保护作用,这一作用可能与其下调肾组织中KCa3.1通道蛋白表达有关.

目的 考察砂仁复方制剂对胃肠动力障碍的改善作用并初步探究其作用机制.方法 将SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组、砂仁复方制剂高、中、低剂量组.除正常组外,其他组采用慢性束缚水浸应激法复制大鼠胃肠动力障碍模型,以多潘利酮为阳性对照,观察砂仁复方制剂对大鼠胃肠动力障碍的影响:测定大鼠胃排空率及小肠推进率,ELISA法检测血浆胃泌素(Gastrin,GAS)、胃动素(Motilin,MTL)、血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)及生长抑素(Somatostatin,SS)水平;western blot检测大鼠结肠组织L型钙离子通道α2亚基的表达;Q-PCR检测大电导钙激活钾离子通道蛋白、电压门控钠离子通道β2亚基表达情况.结果 砂仁复方制剂能改善水浸应激导致的胃肠动力障碍,包括促进胃排空,降低胃残留率;在激素水平提高GAS、MTL的含量,降低SS含量;上调L型钙离子通道α2亚基蛋白表达量.结论 砂仁复方制剂对慢性束缚水浸应激法诱导的胃肠动力障碍有明显改善作用,这一改善作用与升高GAS、MTL含量,降低SS含量,上调L型钙离子通道蛋白表达量有关.

目的 检测中电导钙激活性钾离子通道(IKCa1)在围着床期子宫内膜的表达及其在胚胎着床过程中的作用.方法 分别取分泌和增生早、中、晚期子宫内膜组织各5例.应用qPCR和免疫组化技术检测各期IKCa1 mRNA和蛋白的表达.体外培养人子宫内膜癌Ishikawa细胞,不同浓度(0、10、20、30μmol/L)IKCa1阻滞剂TRAM-34干预后,qPCR检测细胞IKCa1表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞体外胚胎黏附能力,Western blot检测细胞上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E盒结合蛋白1(Zeb1)和上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)表达.结果 IKCa1在人子宫内膜中呈时序性表达,分泌期表达水平较增生期显著增高,以分泌中期最高.TRAM-34抑制IKCa1表达后,Ishikawa细胞增殖和胚胎黏附能力减弱;EMT标志蛋白E-cadherin表达显著上调,Zeb1表达显著下调(P<0.05).结论 IKCa1可能参与围着床期子宫内膜容受性的建立,并通过影响子宫内膜细胞增殖和EMT调控胚胎着床.

内皮细胞(endothelial cell,EC)作为不可兴奋细胞,早前通常被认为缺乏功能性电压门控钙离子通道(voltage-gated calcium channel,VGCC),如人脐静脉内皮细胞、牛肺动脉内皮细胞、牛主动脉内皮细胞等.随着膜片钳技术、荧光显微技术、聚合酶链式反应(PCR)技术的发展,越来越多的VGCC在各种内皮细胞中被发现,如人主动脉内皮细胞、大鼠主动脉内皮细胞、大鼠肺微血管内皮细胞等.目前对于VGCC存在与否主要有3种检测方法:利用膜片钳技术对离子通道电流的检测、利用荧光显微技术对胞内钙离子浓度变化的检测、利用PCR技术对离子通道基因或蛋白质表达的检测.内皮细胞不单单是血液和其他相邻组织细胞及基质蛋白间的物理屏障,更重要的是通过细胞膜上VGCC的开放和关闭对细胞和血管组织的生理变化产生显著的影响.一方面,VGCC对胞内钙离子浓度变化的影响,控制着一氧化氮(NO)等血管舒张因子的释放,调节血管张力的平衡.另一方面,作为钙离子内流重要途经的VGCC,经过Ras和MEK通路的诱导、磷酸化PI3K和Akt通路,影响内皮细胞迁移和增殖.此外,部分生理现象,如血管内压力产生的机械应变和血流相关的剪切应力通过激活机械小体,导致Katp通道关闭,引起内皮细胞膜去极化的方式激活VGCC、部分受体、配体的结合及离子通道的开闭需要VGCC的参与,如激活剂为缓激肽的钾离子通道的开闭,激活剂为组胺的阳离子通道的开闭等.总之,鉴于VGCC具有调控内皮细胞兴奋性、分泌、迁移等重要功能,对其深入而广泛的研究对揭示并治疗诸如原发性高血压、动脉粥样硬化等内皮功能性疾病有十分重要的意义.