目的:探究重组磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R）串联显性表位（PLA2RTD）在去除原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy，PMN）抗PLA2R自身抗体（anti-PLA2R）中的作用。方法:在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞体系中表达重组蛋白分子PLA2RTD（富含半胱氨酸结构域、C型凝集素样结构域1和C型凝集素样结构域7），圆二色谱法测定PLA2RTD的二级结构，酶联免疫吸附测定法和免疫荧光法测定PLA2RTD的生物活性，环氧活化法耦联重组PLA2RTD与琼脂糖凝胶CL-6B微球以制备anti-PLA2R的特异性免疫吸附剂。结果:该研究实现了PLA2RTD在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞系统中的首次表达，证明了PLA2RTD具有良好的免疫原性和较高的结合特异性。PLA2RTD免疫吸附剂体外单次吸附可平均消除76.66%的anti-PLA2R［（6.66±0.30）RU/ml比（28.54±2.10）RU/ml］，吸附完成后血浆中IgG、IgA、白蛋白、β2微球蛋白、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的含量变化<4%，第2～3次重复使用时仍可保持65%左右的吸附效率。结论:基于PLA2RTD的特异性免疫吸附剂能够有效地清除血浆中anti-PLA2R，为特异性清除与PMN相关的自身抗体提供了一种新途径。

目的:筛选表达量高且具有血凝抑制活性的B/Yamagata系流感病毒血凝素(HA)重组蛋白.方法:以B/Singapore/IN-FTT-16-0610/2016的HA为基础,在HA胞外区C末端分别融合GCN4pLL三聚化基序、GCN4pLL-半胱氨酸及GCN4pLL-七鳃鳗可变淋巴细胞受体-B(VLR-B)抗体C端的肽段序列,分别获得HA突变体基因BY-T、BY-LLc及BY-PLc;分别插入pFast-Bac1,采用杆状病毒昆虫细胞表达系统进行表达.表达鉴定后,Strep-Tactin亲和层析纯化,然后鉴定纯化突变体蛋白的寡聚程度及血凝活性.突变体蛋白免疫小鼠,检测免疫血清HA特异性IgG抗体和血凝抑制(HAI)抗体水平.结果:各HA突变体均能够有效表达,BY-T突变体表达水平最高,易于纯化,纯度好,呈多聚化形式存在;BY-LLc及BY-PLc表达水平次之,呈高聚化形式存在.三种HA突变体蛋白的血凝活性相当,均可有效诱发的HA特异性结合的IgG抗体和HAI抗体.结论:HA蛋白胞外区C端融合寡聚化基序GCN4pLL的突变体易于纯化,具有血凝活性,可诱发小鼠产生HA特异性抗体和HAI抗体.研究为B/Yamagata系流感病毒重组蛋白疫苗的研发策略提供了参考.

目的 比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响.方法 选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按照N-端信号肽序列不同[内源(Endo)、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同,分为25组.通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒,建立25组三级毒种库.将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞(2.8×106个/mL)和对数生长中期细胞(1.2× 107个/mL).将各组病毒培养至100mL(500mL摇瓶),进行蛋白表达,并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测.S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组,进行重复验证.结果 B2、C4病毒接种至高密度细胞,分泌表达量未提高,接毒后培养4和5 d的分泌表达量存在显著差异.A7(Endo-S1-tag)的分泌表达量明显低于 A9(HIV-ENV-S1-tag),A4(Gp67-S1-tag)分泌表达量最高,A1(Endo-Endo-S1-tag)分泌表达量显著低于 A7(Endo-S1-tag);B6(HIV-ENV-RBD-tag)分泌表达量显著高于 B4(Gp67-RBD-tag)及其他信号肽组;C4(Gp67-RBD-dimer-tag)分泌表达量明显高于C3(Gp64-RBD-dimer-tag).分别选择每种蛋白表达量较高的2组(A4、A9;B4、B6;C3、C4)进行重复验证确定,结果显示,A4、B6、C4的分泌表达量最高.结论 S1、RBD二聚体蛋白分泌表达量最高的信号肽相同,是GP67信号肽,而RBD蛋白的最适信号肽是HIV-ENV信号肽.表明N-端序列会影响蛋白的分泌,信号肽序列有一定的通用性,但也与要表达的目的蛋白序列有关.

目的 研究斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白S2(PGRP-S2)的功能及其对按蚊体内共生菌稳态的影响.方法 将羽化后2～4日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)、感染血组(叮咬原虫血症为4％～8％的伯氏疟原虫ANKA感染小鼠)和健康血组(叮咬健康小鼠),每组60只,饱血24 h后分离中肠和其余组织,用Trizol法提取RNA,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将羽化后0～1日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)与抗生素处理组(喂食含有青霉素、链霉素和庆大霉素的10％蔗糖溶液),每组30只,喂养5 d后分离中肠和其余组织,RT-qPCR检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将雌性斯氏按蚊分为pgrp-s2敲低组和绿色荧光蛋白基因(gfp)对照组,每组60只,分别注射pgrp-s2的双链RNA(dsRNA)和gfp基因dsRNA(69 nl/只),2 d后每组取蚊虫提取RNA,RT-qPCR检测pgrp-s2的相对转录水平,提取DNA并使用16S rRNA特异性引物PCR检测蚊虫体内共生菌总量.分别取30只pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊,用107个/ml摩氏摩根氏菌液浸湿棉球喂养5 d后,提取RNA,RT-qPCR检测获得共生菌16S rRNA相对总量和摩氏摩根氏菌的相对数量;提取pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊中肠组织RNA,转录组测序后进行聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析.使用SMART网站预测分析PGRP-S2氨基酸序列后利用CLC Main Workbench软件进行比对.克隆按蚊pgrp-s2基因,利用昆虫杆状病毒表达系统(pFastbac Ⅰ)在SF9细胞中表达PGRP-S2重组蛋白,Western blotting检测蛋白表达情况.取10、20、40 μg/ml纯化后的PGRP-S2重组蛋白溶液(以蛋白缓冲液为对照)分别与40 μg赖氨酸(Lys)型肽聚糖和二氨基庚氨酸(DAP)型肽聚糖孵育,每间隔12 h测定相对吸光度(A540值)以判定肽聚糖的降解情况,验证PGRP-S2的酰胺酶活性.结果 RT-qPCR结果显示,吸血后24 h,感染血组、健康血组和对照组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平分别为1 590.0±665.2、126.8±100.4和15.84±6.92,感染血组高于对照组(t=2.38,P＜0.05);对照组按蚊中肠的pgrp-s2的相对转录水平高于其余组织(1.71±0.51)(t=2.04,P＜0.05).抗生素处理组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平为0.33±0.18,低于对照组的117.9±54.5(t=2.16,P＜0.05).pgrp-s2敲低组按蚊体内共生菌16S rRNA相对总量为3 653±2 023,低于gfp对照组的14 982±3 892(t=2.58,P＜0.05);摩氏摩根氏菌饲喂后,pgrp-s2敲低组按蚊体内摩氏摩根氏菌的相对数量为571 517± 61 258,低于gfp对照组的919 754±123 397(t=2.53,P＜0.05).转录组分析结果显示,pgrp-s2敲低可以上调按蚊免疫相关的Toll/Imd通路、mTOR通路、FoxO通路基因,下调脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢相关基因.10、20、40 μg/ml PGRP-S2重组蛋白与DAP型肽聚糖孵育48 h后,相对A540值分别为0.49±0.07、0.40± 0.10和 0.44±0.07,均低于对照的 0.90±0.09(t=3.53、3.65、3.97,均P＜0.05);但与 Lys型肽聚糖孵育 48 h后,相对A540值分别为0.52±0.03、0.62±0.03和0.65±0.04,与对照(0.64±0.05)的差异均无统计学意义(t=1.95、0.31、0.11,均P＞0.05).结论 斯氏按蚊体内pgrp-s2主要在中肠表达,且表达水平受共生菌调控.PGRP-S2重组蛋白可以降解DAP型肽聚糖,具有酰胺酶活性,可通过负调节免疫反应和调节代谢反应调控按蚊体内共生菌水平.

目的 构建人乳头瘤病毒58型L1/E7“假病毒”疫苗,并研究其免疫学特性.方法 采用sf9昆虫-杆状病毒表达系统表达HPV58 L1蛋白,体外解离重组病毒颗粒,向已经解离的衣壳中加入mE7-pcDNA3.1+质粒,CaCl2室温透析促使病毒样颗粒(VLP)重新聚合,用“假病毒”颗粒滴鼻免疫小鼠,检测小鼠血清IgG,IgA中和抗体以及脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.结果 SDS-PAGE,Western blot和红细胞凝集实验证实sf9昆虫-杆状病毒表达系统有效表达有功能活性的HPV58 L1蛋白,HPV58 L1蛋白能够有效的折叠、解聚以及再折叠为VLP.小鼠免疫保护实验发现,用包含有mE7-pcDNA3.1+质粒的HPV58 L1“假病毒”免疫小鼠,抗HPV58L1特异性IgG,IgA明显升高(P＜0.001),“假病毒”免疫组产生的IFN-γ明显高于VLP免疫组(P＜o.001);“假病毒”免疫过的小鼠脾淋巴细胞可以特异性杀伤Tc-1细胞,引起CTL反应.结论 成功制备了人乳头瘤病毒58型L1/E7“假病毒”疫苗,能诱发免疫动物较强的体液免疫反应,激发保护性抗体的产生.

目的 获得在昆虫细胞中有效表达脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的重组杆状病毒,为制备脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗提供了科学依据.方法 将I型脊髓灰质炎病毒( Mahoney株) 的P1基因和3CD基因构建到供体质粒中,通过flashBAC ULTRATM系统制备重组杆状病毒;将Mahoney株的P1基因与Sabin株Ⅲ 型的3CD基因组合,用同样方法构建重组杆状病毒.通过接种昆虫细胞草地贪夜蛾细胞( sf-9细胞) 对两种病毒进行扩增,再接种昆虫细胞粉纹夜蛾细胞( High five细胞) 扩大培养,并通过定量PCR对P1和3CD基因的表达进行验证,利用Western blot检测P1蛋白的表达及被3CD蛋白酶剪切的情况.结果 获得了两株稳定表达脊髓灰质炎病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒.其中,重组杆状病毒( BacU-Mahoney-P1-3CD) 在感染细胞后,3CD蛋白酶表达量较低,不能有效剪切P1前体蛋白;而重组杆状病毒( BacU-Mahoney-P1-Sabin PV3 3CD) 感染细胞后,3 CD蛋白酶的表达量和对P1前体蛋白的剪切效力都有明显提高( P＜0.05).结论将Mahoney株P1基因和Sabin株Ⅲ 型的3CD基因的组合构建重组杆状病毒,可有效地在昆虫细胞中表达P1和3CD基因,并且Sabin株Ⅲ 型的3CD蛋白酶可有效地剪切Mahoney株的P1前体蛋白.

利用BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统表达重组旋毛虫副肌球蛋白(recombinant Trichinella spiralis paramyosin,rTsPmy),以获得生物学活性较好的重组蛋白.通过PCR和DNA重组方法构建含TsPmy基因的Gateway入门载体重组质粒pDONR221(pDONR221/TsPmy),经测序鉴定后,扩增重组质粒;利用重组质粒pDONR221/TsPmy和BaculoDirect线性杆状病毒进行Gateway DNA重组反应,构建重组病毒,用其直接感染昆虫细胞Sf9使得重组病毒具有感染活力;连续感染Sf9以扩增病毒,利用滴度较高的病毒感染Sf9进行rTsPmy表达;SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定表达的重组蛋白rTsPmy.结果显示,重组质粒经测序鉴定显示序列正确;SDS-PAGE及Western blotting显示rTsPmy分子量大小约110 kDa,未见不完全表达;可溶性分析显示rTsPmy部分可溶,大部分为不可溶沉淀;Western blotting结果显示rTsPmy可被旋毛虫感染的小鼠和猪抗血清识别,具有抗原特异性.本研究首次利用BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统成功表达了rTsPmy,获得翻译后修饰更加完善、 纯化效果更好的重组蛋白,对于进一步研究TsPmy的功能,为制备有效的旋毛虫病疫苗候选抗原分子提供了生物学基础.

目的:利用昆虫细胞表达系统生产重组的人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),并进行纯化和抗体结合特性鉴定.方法:以HeLa细胞逆转录的cDNA为模板,扩增人PCNA基因,并插入杆状病毒载体AcMNPV.利用昆虫细胞得到PCNA基因的重组杆状病毒.病毒感染细胞表达蛋白,联合镍柱亲和层析和离子交换层析获得高纯度的重组人PCNA蛋白.ELISA法测定抗体结合特异性.结果:以HeLa细胞cDNA为模板得到的基因序列同GenBank的人PCNA基因序列一致.草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda,Sf9)表达重组人PCNA(recombinant human PCNA,rPCNA)的最佳感染值(MOI)和感染时间分别为0.05h和144h.rPCNA的产量高达110mg/L细胞,纯度＞95％.间接ELISA法检测抗体结合特性,rPCNA的敏感性和特异性分别为93.3％和85.0％.结论:建立了rPCNA的表达和纯化方法,获得了高效表达、高度抗体结合特异性的PCNA蛋白,该蛋白质能进一步开发为PCNA相关疾病的体外诊断试剂盒,具较大的应用价值.

目的:通过条件优化实现人CD4蛋白胞外区在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的高效表达,并对纯化获得的人CD4蛋白胞外区进行抗原性与免疫原性分析.方法:通过选择人CD4分子胞外片段构建重组杆状病毒(pAc-CD4),然后感染昆虫细胞进行蛋白的表达,采用镍离子亲和层析纯化.运用SDS-PAGE、Western blot、体积排阻色谱、ELISA、SPR法等分析纯化得到目的蛋白的理化性质和抗原性.通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫BALB/c小鼠,监测小鼠免疫血清的抗体生成.结果:经纯化可获得纯度90%以上的人CD4蛋白,每升细胞培养液最终可获得11.2 mg的目的蛋白,且该人CD4胞外区蛋白具有良好的抗原性.小鼠血清监测结果显示人CD4蛋白能有效刺激机体产生免疫应答,显示其具有良好的免疫原性.结论:本研究通过杆状病毒-昆虫细胞系统进行高效表达,获得抗原性和免疫原性良好的人CD4胞外区蛋白,为HIV受体和感染的研究奠定基础.

目的 利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α). 方法 根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH 10 Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α.采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力. 结果 重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml. 结论 构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础.