目的:探讨人乳头瘤病毒（HPV）E7蛋白检测在子宫颈意义不明的非典型鳞状细胞（ASCUS）患者分流中的意义。方法:收集2018年3月至12月就诊于南京中医药大学附属昆山医院液基薄层细胞学（TCT）检查结果为ASCUS的205例患者资料。以细胞免疫化学方法对TCT检测后剩余标本行子宫颈脱落细胞HPV E7蛋白检测，并行阴道镜检查及子宫颈活组织病理检查，以组织病理学检查结果为金标准，分析HPV E7蛋白细胞学检测诊断子宫颈病变的效能。结果:205例患者中，子宫颈活组织病理检查结果为炎症144例（70.24%）、低度鳞状上皮内病变（LSIL）32例（15.61%）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）29例（14.15%）。炎症、LSIL、HSIL患者子宫颈脱落细胞HPV E7蛋白的阳性率分别为10.42%（15/144）、75.00%（24/32）、86.21%（25/29），差异有统计学意义（ χ2=97.940， P<0.01）。HPV E7蛋白诊断ASCUS中子宫颈鳞状上皮内病变的灵敏度和特异度分别为80.33%（49/61）和89.58%（129/144）。 结论:HPV E7蛋白检测可以较好分流ASCUS患者，减少不必要的阴道镜及活组织检查，及时发现潜在的高级别病变，避免高危患者漏诊。

目的:探讨血清miRNA-9-5p（miR-9-5p）、miRNA-21-5p（miR-21-5p）和miRNA-3923（miR-3923）对子宫颈癌的诊断价值。方法:收集2016年7月至2018年6月山西省肿瘤医院收治的100例子宫颈癌患者（子宫颈癌组）和同期100名健康体检者（健康对照组）资料。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）结合探针杂交检测子宫颈癌患者石蜡包埋组织和健康对照者子宫颈脱落细胞中人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA的表达水平，以Ct值≤40个循环为HPV E6/E7阳性。取3例子宫颈癌患者与3名健康对照者血清样本，采用微RNA（miRNA）Array检测384个miRNA基因表达量，并进行差异miRNA表达筛选及聚类分析，采用qRT-PCR对筛选的miRNA进行验证。绘制最终筛选的各miRNA及HPV E6/E7单独或联合诊断子宫颈癌的受试者工作特征（ROC）曲线，比较诊断子宫颈癌效能。结果:100例子宫颈癌患者石蜡包埋组织中，HPV E6/E7阳性65例（65%）；100名健康对照者子宫颈脱落细胞HPV E6/E7均为阴性。3例子宫颈癌患者与3名健康对照者血清样本中发现248个差异表达的miRNA，经聚类分析鉴定出前16个调控异常miRNA。经qRT-PCR验证，确认在健康对照组和子宫颈癌组中miR-9-5p、miR-21-5p和miR-3923表达水平差异均有统计学意义（均 P<0.01），选取三者用于后续子宫颈癌的诊断。与健康对照组比较，HPV E6/E7阳性子宫颈癌组miR-9-5p、miR-21-5p和miR-3923表达水平均增高（均 P<0.05），HPV E6/E7阴性子宫颈癌组miR-21-5p和miR-3923表达水平均增高（ P=0.008和 P=0.038）；HPV E6/E7阳性组3个miRNA表达水平均高于HPV E6/E7阴性组（均 P<0.05）。经ROC曲线分析，miR-9-5p、miR-21-5p和miR-3923单独诊断子宫颈癌时，miR-3923的曲线下面积（AUC）最大（0.843），特异度也最高（82%，截断值为2.88）；miR-21-5p的灵敏度最高（85%，截断值为4.08）；3个miRNA联合诊断子宫颈癌的AUC（0.924）和灵敏度、特异度（85%、94%，截断值为4.04）均高于单一指标。HPV E6/E7单独诊断的AUC为0.766，miR-9-5p、miR-21-5p、miR-3923分别联合HPV E6/E7的诊断效能进一步增高，AUC分别为0.914、0.848和0.932；四者联合的诊断效能最高，AUC为0.942。 结论:miR-9-5p、miR-21-5p和miR-3923可能有助于子宫颈癌诊断。

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV) E6/E7 mRNA检测在宫颈上皮内瘤变(CIN)1患者预后中的预测价值.方法 选取2013年7月至2014年10月,于烟台市烟台山医院妇科经阴道镜下宫颈活组织病理学检查,首次确诊为CIN1的107例患者为研究对象.所有受试者均于首次确诊为CIN1前1个月内,同时接受宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)、HPV DNA基因分型及HPV E6/E7mRNA检测;于阴道镜下宫颈活组织病理学检查确诊为CIN1后,对其进行为期2年的随访,每6个月随访1次.随访检查项目包括宫颈TCT、HPV DNA基因分型及HPV E6/E7 mRNA检测,并对可疑病变者予以阴道镜下宫颈活组织病理学检查.根据随访结束时受试者的TCT、HPV DNA基因分型、HPV E6/E7 mRNA检测结果及阴道镜下宫颈活组织病理学检查结果,将本研究受试者分为转阴组与持续或进展组.采用x2检验,对2组受试者的HPV E6/E7 mRNA阳性率进行比较;采用Mann-Whitney U秩和检验,对2组HPV E6/E7 mRNA表达水平进行比较;计算3种宫颈病变筛查方法对于预测CIN1预后的敏感度和特异度;绘制HPV E6/E7 mRNA表达水平预测CIN1预后的受试者工作特征(ROC)曲线,计算ROC曲线下面积(ROA-AUC),根据约登指数最大原则,确定HPVE6/E7 mRNA表达水平预测CIN1预后的最佳临界值,同时计算其敏感度和特异度.本研究遵循的程序符合烟台市烟台山医院伦理委员会所制定的标准,获得该伦理委员会批准,并与受试者均签署临床研究知情同意书.结果 ①根据随访结束时受试者的TCT、HPV DNA基因分型、HPV E6/E7 mRNA检测结果及阴道镜下宫颈活组织病理学检查结果,将本研究受试者分为转阴组(n=63,随访结束时,TCT、HPV DNA基因分型及HPV E6/E7 mRNA检测结果均为正常,或阴道镜下宫颈活组织病理学检查结果为阴性),持续或进展组(n=44,随访结束时,阴道镜下宫颈活组织病理学检查结果为CIN1及以上).2组患者的年龄等一般临床资料比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).②持续或进展组受试者确诊为CIN1时的HPV E6/E7 mRNA阳性率及其中位表达水平分别为61.9％(39/63)和3 738.4 copy/mL,转阴组分别为81.8％(36/44)和583.5 copy/mL,持续或进展组HPVE6/E7 mRNA阳性率及其中位表达水平均显著高于转阴组,并且差异均有统计学意义(x2=4.901,P=0.027;U=821.000,P＜0.001).③HPV-16/18阳性患者CIN持续或进展率为50.8％(31/61),显著高于HPV16/18阴性者的28.3％(13/46),并且差异有统计学意义(x2=5.512,P=0.019).HPV E6/E7 mRNA阳性患者CIN持续或进展率为48.0％(36/75),显著高于HPV E6/E7 mRNA阴性者的25.0％(8/32),并且差异亦有统计学意义(x2=4.901,P=0.027).TCT,HPV DNA基因分型及HPV E6/E7 mRNA定性检测对于预测CIN1患者预后的敏感度分别为50.0％、70.5％、81.8％,特异度分别为66.7％、52.4％、38.1％.④HPV E6/E7 mRNA表达水平预测CIN1患者预后的ROC曲线分析结果显示,HPV E6/E7 mRNA表达水平预测CIN1持续或进展的ROC AUC为0.704(95％CI:0.601～0.806,P＜0.001),HPV E6/E7 mRNA表达水平预测CIN持续或进展的最佳临界值为2 724.0 copy/mL,此时其预测CIN1持续或进展的敏感度为54.5％,特异度为81.0％.结论 HPV E6/E7 mRNA定性检测结果对于预测CIN1患者预后的敏感度较高,而其定量检测结果对于预测CIN1患者预后的特异度较高.HPV E6/E7 mRNA检测可能对CIN1患者预后的预测具有一定临床价值.

目的 探讨流式细胞术检测人乳头瘤病毒( human papilloma virus,HPV) E6／E7 mRNA对于宫颈病变的诊断价值.方法 选取2017年1月至2018年9月山西省妇幼保健院妇产科就诊疑似宫颈病变且行阴道镜下宫颈活检组织检查的妇女119例作为观察对象.应用流式细胞术对妇女宫颈脱落细胞行HPV E6／E7 mRNA检测,应用杂交捕获二代法(digene hybrid capture 2,HC2)检测HPV DNA,阴道镜下宫颈活组织进行病理学分型.结果 119例中31. 09%(37／119)HPV E6／E7 mRNA阳性,57. 14%(68／119)HPV DNA检测阳性. HPV E6／E7 mRNA阳性率在子宫颈上皮内瘤变( cervical intraepithelial neoplasia,CIN)2+组77. 78%(28／36),与CIN1组20. 00%(4／20)比较差异有统计学意义(χ2＝15. 246,P＜0. 01),与未见上皮内病变细胞( NILM)组7. 94%(5／63)比较差异有统计学意义(χ2＝50. 286,P＜0. 01).在 NILM 组 HPV E6／E7 mRNA 阳性率 7. 94%(5／63)与 HPV DNA 阳性率30. 16%(19／63)比较差异有统计学意义(χ2＝10. 088,P＝0. 001),在CIN1组HPV E6／E7 mRNA阳性率20. 00%(4／20)与 HPV DNA 阳性率 85. 00%( 17／20)比较差异有统计学意义( χ2 ＝14. 436,P＜0. 001).流式细胞术检测HPV E6／E7 mRNA诊断宫颈病变的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为75. 00%、89. 16%、72. 72%、90. 24%;HC2方法检测HPV DNA诊断宫颈病变的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为88. 89%、56. 63%、47. 06%、92. 16%.结论 流式细胞术检测HPV E6／E7 mRNA 诊断宫颈病变特异度和阳性预测值优于 HC2 检测 HPV DNA 法. HPV E6／E7 mRNA检测对宫颈癌癌前病变筛查具有潜在临床价值. 85. 00%(17／20),which was statistically significant (χ2＝14. 436,P＜0. 001) . The sensitivity,specificity, positive predictive value and negative predictive value of HPV E6 ／ E7 mRNA detected by flow cytometry were 75. 00%, 89. 16%, 72. 72% and 90. 24%, respectively. The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value ofthe detection of HPV DNA by HC2 were 88. 89%,56. 63%,47. 06%and 92. 16%, respectively. Conclusion The specificity and positive predictive value of HPV E6 ／ E7 mRNA detected by flow cytometry were better than those detected by HC2. The detection of HPV E6 ／ E7 mRNA has potential clinical value in cervical precancerous lesions screening.

背景与目的:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶31(serine/threonine kinases 31,STK31)基因在人类多种癌症中扮演重要角色,且STK31基因的表达受其启动子及第一外显子区甲基化状态的影响;病毒感染与肿瘤组织中某些抑癌基因启动子区高甲基化有关.本研究旨在探讨宫颈癌细胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7癌基因对STK31基因甲基化状态及表达的影响,以及不同种类甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)基因在STK31基因甲基化中的潜在作用.方法:构建外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因共表达慢病毒,分别感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)阴性宫颈癌细胞系HT-3及C33A,获得稳定转染的细胞系;采用亚硫酸氢盐基因组测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS)和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测3种HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa、SiHa和CasKi以及HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3和C33A转染前后STK31基因的甲基化状态;RT-PCR及蛋白[质]印迹法(Western blot)检测上述宫颈癌细胞系中STK31基因的表达以及DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因在HPV16转染前后宫颈癌细胞系及HPV阳性、HPV阴性宫颈癌组织中的表达情况.结果:外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因可在HPV阴性宫颈癌细胞系中稳定表达.3种HPV阳性细胞系HeLa、SiHa和CasKi中STK31基因呈低甲基化状态,STK31 mRNA及蛋白质表达阳性;2种HPV阴性细胞系HT-3、C33A中STK31基因则表现为高甲基化状态,STK31 mRNA及蛋白质表达缺失;与未感染慢病毒HT-3和C33A细胞系比较,外源性HPV16 E7以及E6/E7表达的HT-3和C33A细胞系STK31基因甲基化程度降低,其mRNA及蛋白质重新表达.DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因在HT-3E6/E7和C33AE6/E7细胞系中mRNA水平分别高于HT-3空载细胞系和C33A空载细胞系,差异有统计学意义(P<0.001).DNMT1、DNMT3a和DN-MT3b基因的mRNA水平在HPV16阳性宫颈癌组织中的表达高于其在HPV阴性宫颈癌组织中的表达,差异有统计学意义(t=5.997,P<0.001;t=6.743,P<0.001;t=7.926,P<0.001).DNMT2在HT-3E6/E7和C33AE6/E7细胞系中mRNA表达水平分别低于HT-3空载细胞系和C33A空载细胞系,差异有统计学意义(t=7.451,P<0.001;t=2.451,P<0.05);DNMT2基因转录水平在HPV16阳性宫颈癌组织中低于HPV阴性宫颈癌组织(t=9.134,P<0.001).DN-MT3L mRNA表达水平在宫颈癌细胞系转染前后及HPV阴阳性宫颈癌组织中的差异无统计学意义(P>0.05).结论:HPV感染可导致STK31基因启动子及第1外显子区甲基化状态降低,低甲基化状态促进该基因表达.STK31基因的表达受其启动子及第1外显子区甲基化状态的调控.HPV16 E7、E6/E7基因可能通过影响DNMT2的表达参与调控癌基因STK31基因启动子及第1外显子区甲基化状态.

目的 研究中国东北地区人乳头瘤病毒31(HPV31)E6和HPV31?E7基因多态性.方法 首先将从已确诊HPV31阳性患者宫颈细胞中提取的DNA,应用巢式PCR对E6和E7基因片段进行扩增并测序,再与参考序列比对找到突变位点.应用MegaX软件进行序列比对以及系统发育树的构建,应用PAML软件分析点突变中的正向选择位点,应用PSIPred?server预测HPV31?E6和E7蛋白质二级结构,应用ABCPred?server寻找理想的B细胞免疫表位,应用ProPred-Ⅰserver和ProPred?server分别预测人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类和HLAⅡ类结合表位.结果 成功扩增和测序HPV31?E6和E7序列各151个.与参考序列(J04353.1)比对后发现,E6基因中检测到单核苷酸突变25个,E7基因中检测到单核苷酸突变8个.系统发育分析显示,中国东北地区HPV31?E6和E7基因均以A谱系最为流行.研究观测到的大部分非同义突变存在于预测表位中.结论 HPV31?E6和E7基因组在东北地区呈基因多态性分布,并以A谱系为主.

高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染与多种人类癌症密切相关,其中最典型的是宫颈癌.高危型HPV最重要的两个病毒癌基因为E6和E7,病毒基因组整合到宿主基因组是病毒癌基因E6和E7实现持续表达的一种方式.HPV癌基因E6和E7能够靶向宿主细胞途径,通过这些相互作用,导致HPV发挥其在细胞中的致癌作用.对于病毒癌基因E6和E7研究最充分的细胞靶点分别是p53和pRb,然而,最近的研究表明这两种病毒蛋白具有调节更多细胞作用靶点的能力,包括细胞中调节表观遗传标记和剪接变化的蛋白质等.高危型HPV E6和E7蛋白通过调节这些靶点使细胞发生过度增殖和致癌作用.

目的 探讨人乳头瘤病毒52型(HPV52)E6和E7基因多态性与宫颈上皮内瘤变(CIN)的相关性.方法 收集来自青岛地区的177例HPV52阳性且进行宫颈活检病人的宫颈脱落细胞样本,采用PCR直接测序法检测E6和E7基因序列,在GenBank中剪切HPV52标准株和变异株序列,应用Lasergene和MEGA软件对序列进行比对和系统进化树分析.比较正常、低级别上皮内瘤变(CIN1)和高级别上皮内瘤变(CIN2/3)样本中E6和E7基因变异型的分布.结果 138例样本成功获得E6和E7基因序列.与标准株比较,132例(95.7％)样本在E6区同时出现1处错义突变(K93R)和1处同义突变(g350t),经系统进化树分析,确定为B变异型;其余样本有5例(3.6％)属于A变异型,1例(0.7％)属于C变异型.135例(97.8％)样本在E7区同时出现2处同义突变(c751t和a801g),为B变异型;其余样本有2例(1.5％)属于A变异型,1例(0.7％)属于C变异型.正常、CIN1和CIN2/3样本之间E6和E7变异型的分布差异均无显著性(P>0.05).结论 来自青岛地区正常及CIN样本中HPV52 E6和E7基因均以亚洲株B变异型为主,E6和E7基因多态性可能与CIN发生发展无明显相关性.

乳头瘤病毒（PV）转录的主要调节因子是E2蛋白。在人乳头瘤病毒中，E2蛋白调节癌基因E6和E7的表达。E2行使功能的方式是与靶DNA的一段由12个碱基对组成的回文序列（E2-BS）发生特异的相互作用。因此，阐明E2蛋白对靶DNA的选择性立体化学机制是研究此类致癌病毒转录调节的关键。牛PV-1（BPV-1）E2蛋白的靶DNA结合区的晶体结构显示出一种新的二聚体形式蛋白/DNA结合方式。蛋白质为二聚体β-折叠桶，其外表面为起识别作用的α-螺旋。DNA/蛋白界面上分布着复杂交织的氢键网，DNA光滑地环绕于E2β-折叠桶上，并将识别性α-螺旋包绕于DNA大沟中。